西伯利亞蓼抗病基因克隆、雙價載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、根據(jù)西伯利亞蓼抑制消減文庫(SSH)中獲得的硫堇基因(THI)、幾丁質(zhì)酶基因(CHI)和葡聚糖酶基因(GLUC)的部分序列，應(yīng)用RACE技術(shù)同時克隆了THI、CHI和GLUC基因全長的cDNA序列，生物信息學(xué)分析表明，西伯利亞蓼THI(PsTHI1)與鼠尾草(Salvia miltiorrhiza)等植物THI有較高的同源性，具保守的植物THI標(biāo)簽，此成熟THI帶正電荷，偏堿性，推定可能具有抗病原微生物活性，為一種新的植物THI;西伯利

2、亞蓼CHI(PsCHI1)具保守的植物幾丁質(zhì)酶(CHI)家族19標(biāo)簽1序列特征，與植物classⅣCHI前體序列具有高度的同源性，推測為植物classⅣ CHI，分泌到細(xì)胞外，無跨膜區(qū)，根據(jù)其它植物CHI的結(jié)構(gòu)域，確定PsCHI1具有能夠水解真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，推測其可能有抗真菌病的功能;西伯利亞蓼GLUC(PsGLUC1)所編碼的蛋白(PsGLUC1)呈酸性，帶負(fù)電荷，該編碼蛋白與水稻(Oryza sativa L.japonica)內(nèi)

3、切型1，3;1，4-β-D-葡聚糖酶(endo-1，3;1，4-beta-D-glucanase)有較高的同源性，故初步推斷PsGLUC1屬于葡聚糖酶家族。采用實時熒光定量PCR技術(shù)，研究了PsGLUC1和PsCHI1基因在西伯利亞蓼不同組織、不同時間的鹽堿脅迫及去脅迫過程中表達(dá)特性。結(jié)果表明，PsCHI1基因表達(dá)具明顯的組織特異性，無論在非脅迫、NaHCO3脅迫還是去脅迫過程葉部的表達(dá)量明顯高于莖部的表達(dá)量。PsGLUC1基因表達(dá)不具

4、明顯的組織特異性，在莖和葉中均有表達(dá)。在鹽堿脅迫條件下，兩個基因在莖和葉中均具有不同的表達(dá)模式。另外，無論在莖還是葉部，PsCHI1基因與PsGLUC1基因均受鹽堿脅迫的影響。
　　以已構(gòu)建的PsCHI1/pROKⅡ和PsGLUC1/pROKⅡ兩個單價載體為基礎(chǔ)，采用“中間載體pGEM-T easy更換酶切位點法”和“35S和Tnos引物PCR方法”，均成功構(gòu)建35 S-PsGLUC1-Tnos-35 S-PsCHI1-Tnos/

5、pROKⅡ植物雙價表達(dá)載體。通過對兩種方法的分析比較，結(jié)果表明“35S和Tnos引物PCR方法”能夠快速高效構(gòu)建具完整表達(dá)框的pROKⅡ植物雙價表達(dá)載體。應(yīng)用此法去除了中間載體更換酶切位點的繁瑣過程，減少了連接、轉(zhuǎn)化的次數(shù)，明顯地提高了工作效率。
　　構(gòu)建了EHA105(PsCHI1/pROKⅡ)、EHA105(PsGLUC1/pROKⅡ)兩個單價農(nóng)桿菌工程菌株和EHA105(PsCHI1-PsGLUC1/pROKⅡ)一個植物雙價