硫化氫對急性病毒性心肌炎心肌損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、背景：病毒性心肌炎(VMC)是因病毒感染和自身免疫反應共同引起的心臟局灶性或彌漫性炎癥病變的一種急性或慢性心肌炎性疾病。引起病毒性心肌炎的病毒已知有腸病毒、腺病毒、流感病毒等20多種病毒，腸病毒的柯薩奇病毒3(CoxsackievirusB，CVB)最為常見，約占50％[1]。病程可呈急性或慢性，大多數(shù)可痊愈，約15%的患者由于急性期病情反復發(fā)展為擴張型心肌病（DMC）。臨床上在新生兒、小兒突發(fā)死亡病例中20%因CVB3誘導的VCM所致

2、，死亡率逐年攀升[2]，對小兒和青少年的健康和生命帶來極大威脅。CVB3引起的心肌炎癥損傷，進而發(fā)展為擴張型心肌病甚至心力衰竭的病理過程的具體機制還不十分清楚，但越來越多的實驗研究表明，心肌細胞凋亡是病毒性心肌炎發(fā)生發(fā)展的重要機制之一[3]，通過干預凋亡基因的表達阻斷心肌細胞凋亡過程以起到保護心肌的方法備受人們關注，P53作為一個高效的凋亡啟動因子，在細胞凋亡過程中起著十分重要的調控作用，通過P53泛素化通路對心肌細胞凋亡的調控，可能是

3、治療VMC的重要靶點。硫化氫(H2S)作為繼一氧化氮和一氧化碳之后第三種氣體信號分子近年來備受關注，國內外研究者發(fā)現(xiàn)，在大量心肌疾病動物模型研究中被證實硫化氫能通過抑制炎癥反應，調控心肌細胞凋亡相關基因及蛋白的表達，發(fā)揮出抗炎癥、抗細胞凋亡的生物學效應[4]。在體內外實驗研究證實在CVB3所致對VMC模型中，外源性硫化氫（NaHS）可通過多個環(huán)節(jié)影響病毒性心肌炎的發(fā)展，發(fā)揮著減少自由基損害及抑制炎癥反應的作用。在大鼠缺血再灌注模型中還起

4、到抑制心肌細胞凋亡，調控凋亡相關蛋白表達的作用，但對其抗VMC心肌細胞凋亡的作用及作用機制目前國內外研究報道甚少。
　　目的：本實驗研究NaHS對CVB3誘導的急性病毒性心肌炎Balb/c小鼠心肌的保護作用，及對心肌細胞凋亡相關蛋白P53、BAX／BCL--2表達的影響，并進一步探討NaHS在VMC中調控心肌細胞凋亡及其抗凋亡的作用機制。
　　方法：實驗分兩部分。第一部分，將50只4--5周齡近交系純種雄性Balb/C小鼠隨

5、機分為N組（正常對照組，n=10）、C組（CVB3病毒對照組，n=20）、H組（NaHS治療組，n＝20），C、H組小鼠腹腔反復接種CVB3病毒，H病毒感染同時分別給予硫化氫，N組每天腹腔注射生理鹽水，每日1次，共7天，建立急性病毒性心肌炎Balb/c小鼠模型，觀察并記錄硫化氫對小鼠一般情況及生存情況，根據(jù)各時間點小鼠生存數(shù)，繪制生存曲線進行生存分析；死亡小鼠無菌取出心臟稱重，計算HM/BM，并通過HE染色觀察各組小鼠心肌病理改變及病理

6、積分，TUNEI法檢測心肌細胞凋亡數(shù)、Westernblot法檢測心肌凋亡相關蛋白P53、BAX／BCL--2的表達；第二部分實驗將70只Balb/c小鼠隨機分為4組，N組（正常對照組， n=10）、C組（CVB3病毒對照組，n=20）、H組（NaHS治療組，n＝20）、H+P組（Pifithrin--α＋NaHS，n=20），造模同前，H組處理同前，H+P組病毒感染同時予以P53抑制劑，每日1次，共7天，連續(xù)觀察15天，并各

7、組小鼠在病毒感染后的第3d、7d、10d、14d各組隨機取3--4只稱重處死，無菌取心臟稱重，HE染色光鏡下觀察心肌病理改變，TUNEI法檢測心肌細胞凋亡數(shù)，并用Westernblot法檢測P53泛素化及相關調節(jié)因子MDM2/MDMX、COP1以及P53轉錄相關凋亡蛋白BCL--2、BAX、PUMA、Caspase--3蛋白表達，以進行數(shù)據(jù)相關研究。
　　結果：1）實驗過程中，N組小鼠體重增加，未出現(xiàn)死亡，心肌病理改變未見異常，與

8、N組相比較，C組小鼠的體重明顯下降，生存率降低，HM/BM比值增大，心肌病理積分明顯增加，心肌細胞凋亡指數(shù)上升；H與C組相比較，H組小鼠的一般情況明顯改善，生存率提高，HM/BM比值降低，心肌病理積分明顯減少，心肌細胞凋亡指數(shù)下降。與N組比較，C組P53蛋白表達水平顯著增加（p<0.01）， BCL--2表達明顯下降，而BAX表達增強，Caspase--3活性明顯增加；予以NaHS干預，H組P53蛋白水平表達較C組明顯降低（p<0.05

9、），BAX蛋白表達明顯降低， BCL--2蛋白表達明顯高于C組，Caspase--3活性明顯下降。
　　2）與N組比較，C組心肌組織中P53及P53磷酸化蛋白、MDM2蛋白表達增加，PUMA、Caspase--3蛋白表達均明顯增加，MDMX、COP1蛋白表達明顯減少；給予NaHS干預治療后,與C組比較，H組P53及P53磷酸化蛋白表達減少，MDM2蛋白表達下降，BAX、PUMA蛋白表達明顯減少，MDMX、COP1、BCL--2蛋白

10、表達增加（p<0.05）；但NaHS+P53抑制劑干預后，H+P組小鼠生存率，心肌病理改變、心肌細胞凋亡指數(shù)與C組相比，差異無顯著性（p>0.05）；但與H組比較，H+P組P53及磷酸化P53、MDM2、BAX、PUMA蛋白表達升高，MDMX、COP1、BCL--2蛋白表達繼續(xù)減少，Caspase3活性明顯增加。
　　結論：NaHS對CVB3誘導的Balb/c小鼠急性VMC模型心肌細胞凋亡有明顯的保護作用，其作用機理可能是通過調控