PI3K抑制劑LY294002誘導HESC定向分化為胰島素分泌細胞的研究.pdf

1、目的：
　　誘導人胚胎干細胞定向分化為胰島素分泌細胞是目前生殖生物學與糖尿病研究領域的前沿課題，它為通過細胞替代治療糖尿病提供新的途徑。多種誘導方法不斷被嘗試，但獲得細胞多為不成熟的胰島分泌細胞前體細胞。本文探討磷脂酰肌醇3激酶抑制劑LY294002對人胚胎干細胞(human embryonic stem cells,HESC)定向分化為胰島素分泌細胞的影響，嘗試獲得功能更加成熟的胰島素分泌細胞。
　　方法：
　　體外

2、通過五個階段誘導人胚胎干細胞定向分化為胰島素分泌細胞。人胚胎干細胞培養(yǎng)在由3000γ射線滅活的小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層上。人胚胎干細胞培養(yǎng)體系:80％knockout DMEM、20％血清替代品、2mM谷氨酰胺、0.1mM2-巰基乙醇、1％非必須氨基酸和4ng/ml堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）。細胞融合80％時，用1mg/ml膠原酶IV消化后，轉(zhuǎn)入細菌培養(yǎng)皿懸浮培養(yǎng)7天形成擬胚體（EB），其培養(yǎng)體系為:DMEM/F12（1:1）、

3、20％血清替代品、2mM谷氨酰胺和1％非必須氨基酸。在無血清培養(yǎng)體系下將形成的EB移至0.1%明膠包被的10cm培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)體系：DMEM／F12、2mM谷氨酰胺、5μg/ml纖粘連蛋白和1% ITS，對巢蛋白陽性細胞進行篩選(ITS)。之后進行巢蛋白陽性細胞擴增(N2)。最后去除bFGF，分別給予尼克酰胺+B27（B27組）為對照組和尼克酰胺+LY294002(LY組)為實驗組誘導胰島素分泌細胞的成熟。顯微鏡下觀察各階段細胞形態(tài)變化

4、，免疫熒光染色分析胰島細胞特異蛋白的表達；通過體外胰島素誘導釋放實驗初步評價細胞的分化及其功能。
　　結果：
　　通過ITS條件培養(yǎng)液篩選出巢蛋白陽性細胞，細胞免疫熒光可呈現(xiàn)細胞核的胰島素陽性染色和核膜的巢蛋白陽性染色且兩者呈共染狀態(tài)。誘導分化第4階段添加bFGF以后巢蛋白陽性細胞進入快速增長期，第7天表現(xiàn)為胰島素的核膜染色，細胞核中心逐漸淡染，巢蛋白逐漸呈現(xiàn)出核膜與細胞核的全染狀態(tài)。誘導第五階段7天后，LY組胰島素免疫熒光

5、單染陽性率為（82.7±17.5）%高于B27組的（52.6±14.6）%（P<0.05），但LY組生長抑素和胰高血糖素單染陽性率，胰島素/生長抑素共染率和c-肽/胰高血糖素共染率分別低于B27組（P<0.05）。誘導第五階段14天后，LY組胰島素免疫熒光單染陽性率與B27組胰島素單染陽性率差異無統(tǒng)計學意義，但生長抑素和胰高血糖素單染陽性率，胰島素/生長抑素共染陽性率仍低于B27組（P<0.05）。B27組和LY組各誘導1周以后，在高糖

6、（25mM）DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)1小時后，LY誘導組細胞胰島素釋放量高于 B27誘導組，分別為428.3±43.9μIU/ml/mg蛋白及259.2±18.5μIU/ml/mg蛋白，兩組之間差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)；2.5小時后， LY誘導組細胞胰島素釋放量仍高于 B27誘導組細胞，分別為515.3±24.0μIU/ml/mg蛋白及258.7±17.8μIU/ml/mg蛋白，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，體外可以檢測到胰