兩種蜻蜓腸道菌的分離鑒定及代謝產(chǎn)物研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、昆蟲共生菌是一類長期與昆蟲共進化的微生物,具有非常豐富的物種多樣性及代謝途徑多樣性。昆蟲腸道菌是昆蟲共生菌中的一種。目前已有的報道證實,昆蟲腸道菌能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的天然產(chǎn)物,而且從多種昆蟲腸道菌中分離鑒定了許多微生物新種,可能是人類重要的微生物資源。
  本文以蜻蜓目中黃蜻幼蟲和豆娘為研究對象,利用可培養(yǎng)方法、形態(tài)學及分子生物學手段,對黃蜻腸道共生真菌的多樣性性進行了分析,利用PCR擴增及激光共聚焦顯微鏡對真菌內(nèi)共生細菌進

2、行了初步分析,對1株豆娘腸道真菌進行了分離與鑒定。結(jié)合粗提物活性測試結(jié)果,對其中2株黃蜻腸道真菌(QTYC11與QTYC1)及1株豆娘腸道真菌(DN02)的代謝產(chǎn)物進行了進一步研究,采用多種色譜分離技術(shù)(硅膠柱層析、LH-20葡聚糖凝膠柱層析、反相柱層析、HPLC等)對代謝產(chǎn)物進行分離,綜合運用多種波譜技術(shù)(1H-NMR,13C-NMR,HMQC,COSY,HMBC以及ESI-MS等)鑒定代謝物結(jié)構(gòu)。共分離得到12個單體化合物,鑒定了1

3、1個化合物,其中1個單體化合物為新化合物,并在此基礎上進一步研究了單體化合物的除草和抗菌等生物活性。分述如下:
  1、對黃蜻幼蟲腸道真菌多樣性進行了初步的研究。利用稀釋平板法對腸道內(nèi)生真菌進行分離,結(jié)合真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)測序分析的方法對真菌進行鑒定。結(jié)果共得到48株腸道真菌,分屬于4大類,11種不同屬,其中包括1株新菌種。以真菌的基因組DNA為模板,以27F,1492R為引物進行16S rDNA序列擴增,在48株菌種中共獲得有14株細

4、菌(14/48)的16S DNA序列。測序結(jié)果表明大多數(shù)細菌屬于變形菌(13/14),另外還包括1株芽孢桿菌(1/14),其中Leclercia sp.,Oceanobacillus.oncorhynchi和Methylobacterium.extorquens作為真菌內(nèi)共生細菌為首次報道。在此基礎上進一步利用激光顯微鏡,對生存在真菌活菌絲內(nèi)的共生細菌進行SYTO9熒光染色,通過觀測發(fā)現(xiàn)在QTYC45真菌中確實存在內(nèi)生細菌。采用濾紙片擴

5、散法測定了真菌代謝產(chǎn)物對大腸桿菌(ATCC8739),枯草芽孢桿菌(ATCC6633)和金黃色葡萄球菌(ATCC6538)的抗菌活性,48株真菌中近50%的菌株具有良好的抗菌效果。進一步研究表明分離得到的新菌株QTYC44具有很好的纖維素酶活性,發(fā)酵6d后的發(fā)酵液纖維素酶活可達到1654.6 U/mL。本研究首次報道了黃蜻幼蟲腸道真菌的多樣性及其抗菌活性,結(jié)果表明,黃蜻幼蟲腸道內(nèi)生真菌不僅具有豐富的多樣性也是生物活性物質(zhì)的重要潛在來源。

6、
  2、對黃蜻幼蟲腸道共生真菌Paraphaeosphaeria sp.QTYC11的活性代謝產(chǎn)物進行了分離與鑒定。從QTYC11中分離得到10個化合物,鑒定了其中9個化合物(1-9),包括1個新化合物lunatoic acid C(1)?;钚詼y試結(jié)果表明:化合物1和6對反枝莧(Amaranthus retroflexus)具有很好的抑制活性,其IC50分別為10.2和27.6μg/mL;代謝物1和4對稗草(Echinochlo

7、a crusgalli)具有很好的抑制活性,其IC50分別為5.9和16.0μg/mL;盆栽實驗表明化合物1可以很好的抑制稗草幼苗的生長,可以降低幼苗46.0%干重??拐婢钚詫嶒灡砻骰衔?對蘋果腐爛病菌(Valsa mali, IC50=3.3μg/mL),小麥赤霉病菌(Gibberella sanbinetti, IC50=1.7μg/mL)和黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum,IC5

8、0=4.2μg/mL)具有很好的抑制活性,與陽性對照放線菌酮活性相當。此外化合物1也顯示了良好的抗細菌活性,對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈分別為17.1和28.3 mm。
  3、對黃蜻幼蟲腸道共生真菌Curvularia crepinii QTYC-1的活性代謝產(chǎn)物進行了分離與鑒定。離體活性測試發(fā)現(xiàn)C.crepinii QTYC-1發(fā)酵液可顯著抑制稗草和反枝莧幼根的生長,其最大抑制率分別可達95.0%和90.1%,并可使

9、經(jīng)噴施發(fā)酵液的稗草幼苗的受害率達到71.1%。發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物對稗草和反枝莧幼根具有很好的抑制效果,在100μg/mL的濃度條件下,粗提物對稗草和反枝莧的抑制活性分別為56.8%和71.2%,且在該濃度條件下其對一些常見農(nóng)作物具有很好的安全性,其抑制率均低于35%。發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物對楊樹潰瘍病菌(Dothiorella gregaria)、番茄早疫病菌(Altemariasolani)、苦瓜枯萎病菌(Fusarium.oxy

10、sporum f.sp.mornordicae)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium.oxysporumf.sp.cucumerinu)、小麥赤霉病菌(Gibberella sanbinetti)也具有很強的抑制作用,在25μg/mL濃度下,抑制率分別為69.0%、86.3%、46.6%、74.3%和71.2%,與陽性對照放線菌酮的活性相當。進一步從其乙酸乙酯提取物中分離得到化合物(5Z)-7-oxozeaenol(11),活性測試表明,在

11、100μg/mL的濃度條件下,化合物11對稗草和反枝莧的抑制活性分別為56.8%和71.2%。
  4、對豆娘幼蟲腸道共生真菌Cochliobolus lunatus DN02的活性代謝產(chǎn)物進行了分離與鑒定。測試結(jié)果表明DN02乙酸乙酯粗提物對稗草和反枝莧具有較強的抑制活性,對幼根抑制活性的IC50分別為22.9μg/mL和136.7 pg/mL;當噴施發(fā)酵液原液時,稗草受害率、平均株高、平均鮮重分別為66.7%、5.2 cm、1

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