非PLC依賴PKC通路特異性甲狀旁腺素模擬肽的建立及其對(duì)骨代謝作用的初步研究.pdf

1、甲狀旁腺素(PTH)是目前應(yīng)用于臨床的唯一促骨形成藥物，它可以有效增加骨量，治療骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松性骨折、關(guān)節(jié)假體松動(dòng)及長(zhǎng)期使用二磷酸鹽引起的非典型骨折等。
　　PTH激活不同的信號(hào)通路與其自身的多肽結(jié)構(gòu)密不可分，任何氨基酸的突變及構(gòu)象的改變都有可能導(dǎo)致某些信號(hào)通路激活能力的缺失。研究證實(shí)，改變PTH的氨基酸序列能改變PTH的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特征，如PTH(1-34)片段中，1-3位的氨基酸決定PTH的cAMP/PKA和PLC信號(hào)通路的激

2、活功能;Ser1變成Gly1可使得PTH(1-34)失去激活PLC的能力;第19位氨基酸Glu19變成Arg19能夠補(bǔ)償29-34氨基酸殘基缺失引起的受體結(jié)合力減弱;Leu24，Leu28，va131突變成Glu后，PTH(5-34)不與受體結(jié)合;Aib1,3,Nle8,21，Gln10，Har11，Ala12，Trp14，Arg19構(gòu)成的組合突變亦稱M突變，M突變可使PTH(1-34)的cAMP合成能力提高約40倍，PLC的激活能力提

3、高66倍，與PTHR的結(jié)合力提高約10倍;在PTH(1-34)中，Ile5，Glu19，Val21等位點(diǎn)的突變嚴(yán)重干擾PTH(1-34)與受體的結(jié)合力; PTH(1-34)第1、3位氨基酸突變成氨基異丁酸(Aib)后促進(jìn)與PTHR的結(jié)合和cAMP的形成。根據(jù)以上模擬肽結(jié)構(gòu)的研究基礎(chǔ)，我們擬通過(guò)氨基酸突變的方法來(lái)達(dá)到基本不影響PTH肽與受體結(jié)合能力，屏蔽cAMP/PKA和PLC激活能力的目的，設(shè)計(jì)nonPLC/PKC通路特異性PTH模擬肽

4、的序列。
　　我們的前期研究也表明，Gly1Arg19hPTH(1-28)(GR(1-28))和Gly1Arg19hPTH(1-34)(GR(1-34))均失去了激活PLC的能力，但GR(1-34)仍可激活PKC，而GR(1-28)卻沒(méi)有這樣的作用，即PTH可以通過(guò)nonPLC/PKC通路激活PKC，且功能區(qū)域是PTH(29-34)片段。通過(guò)C57BL小鼠皮下注射觀察發(fā)現(xiàn)，GR(1-34)顯著增加骨量，尤其是受力的松質(zhì)骨區(qū)域，顯著

5、強(qiáng)于GR(1-28)的作用，盡管后者具有與前者相同的cAMP激活特性，提示PTH作用下nonPLC/PKC通路的激活能夠促進(jìn)受力區(qū)松質(zhì)骨合成，改善骨小梁微結(jié)構(gòu)，促進(jìn)新骨的形成。近期我們發(fā)現(xiàn)GR(1-34)具有比PTH(1-34)和GR(1-28)更強(qiáng)的促進(jìn)脊柱融合的作用，具有一定通路選擇性的PTH模擬肽具有較PTH更好的促骨形成作用和改善骨微結(jié)構(gòu)的功能。但是nonPLC/PKC通路的具體信號(hào)介導(dǎo)分子仍不清楚，其對(duì)于骨代謝的作用機(jī)制仍需要

6、深入研究。因此我們擬設(shè)計(jì)和篩選nonPLC/PKC信號(hào)通路選擇性PTH模擬肽，并分析該通路特有的下游效應(yīng)分子，進(jìn)一步探討PTH通過(guò)nonPLC/PKC信號(hào)通路促進(jìn)骨形成的作用機(jī)理。
　　目的:
　　利用原代成骨細(xì)胞，通過(guò)相關(guān)信號(hào)通路屏蔽和基因表達(dá)分析，篩選與核實(shí)甲狀旁腺激素29-34位蛋白結(jié)構(gòu)域(PTH(29-34))的效應(yīng)基因，分析其對(duì)骨代謝的影響。以PTH結(jié)構(gòu)為模板，通過(guò)改變其氨基酸序列，構(gòu)建nonPLC/PKC信號(hào)通路

7、選擇性PTH模擬肽，并在相關(guān)通路阻滯劑與激活劑的干擾下利用FRET技術(shù)和ELISA法對(duì)其信號(hào)特征進(jìn)行驗(yàn)證核實(shí)。并研究新肽對(duì)成骨相關(guān)基因的影響，探究PTH/nonPLC/PKC通路的骨代謝功能。
　　方法:
　　2～3日齡C57BL乳鼠10只，取顱蓋骨分離培養(yǎng)成骨細(xì)胞，經(jīng)成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)14d和28d時(shí)分別進(jìn)行ALP染色和茜素紅染色，鑒定原代成骨細(xì)胞。取貼壁生長(zhǎng)的第1代細(xì)胞，分別接受100 nmol/L GR(1-28)，10

8、nmol/L GR(1-34)，10nmol/L PTH(1-34)及空白對(duì)照作用4h，提取總RNA，行小鼠全基因組表達(dá)譜芯片分析，進(jìn)行相關(guān)通路分析，并篩選出可能與nonPLC/PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)的差異表達(dá)基因。RT-PCR篩選及驗(yàn)證上述差異表達(dá)基因。培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞，使用cAMP通路抑制劑（RP-cAMP）阻斷PTH誘發(fā)的cAMP/PKA信號(hào)通路，比較GR(1-28)和GR(1-34)引起的基因變化情況。
　　構(gòu)建P

9、THR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染CKAR報(bào)告分子后，利用PKC激活的熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)，檢測(cè)PTHR穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞在cAMP通路抑制劑（RP-cAMP）干擾下分別接受GR(1-28)和GR(1-34)刺激下PKC的激活情況，確定PTH的nonPLC/PKC通路相關(guān)區(qū)域。
　　以PTH氨基酸為基礎(chǔ)，用氨基酸突變的方法增強(qiáng)nonPLC/PKC通路相關(guān)區(qū)域作用，合成PKA-PLC-PKC+肽（MY1肽）。用FRET技術(shù)檢測(cè)

10、MY1肽對(duì)轉(zhuǎn)染CKAR的PTHR穩(wěn)轉(zhuǎn)HEK293細(xì)胞中PKC的激活能力，并觀察加入PKC抑制劑(Go6983)后PKC激活的變化情況，檢測(cè)MY1肽作用下轉(zhuǎn)染CKAR的HEK293細(xì)胞(無(wú)PTHR)中PKC的激活情況，探究其與PTHR的關(guān)系。用ELISA法檢測(cè)MY1肽對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞中cAMP、PLC激活能力。以驗(yàn)證核實(shí)MY1肽為PTH的nonPLC/PKC通路特異性模擬肽。
　　MC3T3-E1細(xì)胞分別接受10umol/L

11、MY1肽、10umol/L PTH(3-34)、100nmol/LPTH(1-34)及空白對(duì)照組作用4h，提取總RNA，RT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　原代培養(yǎng)成骨細(xì)胞的形態(tài)較均一，呈梭形或多邊形。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，見(jiàn)細(xì)胞排列緊密，呈鋪路石狀。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14d，細(xì)胞排列緊密，呈復(fù)層生長(zhǎng)，行ALP染色，鏡下顯示胞質(zhì)中出現(xiàn)藍(lán)色顆粒，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)至28d行茜素紅染色，鏡下顯示出現(xiàn)紅染的礦化結(jié)節(jié)。行小鼠全基因組芯

12、片檢測(cè)，通過(guò)相關(guān)通路分析，得到了最可能與PTH的nonPLC/PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的14條信號(hào)通路。根據(jù)芯片結(jié)果，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步分析，我們挑選出了與PTH的nonPLC/PKC信號(hào)通路相關(guān)性最高的56個(gè)基因，作為RT-PCR篩選驗(yàn)證的基因?qū)ο?。篩選的56個(gè)基因中，我們發(fā)現(xiàn)CITED1的表達(dá)量PTH(1-34)組明顯高于其他各組，且GR(1-34)組顯著高于GR(1-28)組，PTH(1-34)與GR(1-34)組均顯著高于空白對(duì)照組。MC

13、3T3-E1細(xì)胞經(jīng)各組模擬肽刺激后，提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，CITED1的表達(dá)量GR(1-34)組仍顯著高于GR(1-28)組，與原代成骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，且在加入PKC抑制劑后，CITED1表達(dá)量明顯下降，證實(shí)CITED1表達(dá)量的升高由nonPLC/PKC通道激活引起，不依賴PLC及PKA的激活。
　　PTHR穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞經(jīng)PKC特異性激活劑TPA刺激后，PKC被激活，C/Y值顯著增高，表明我們檢測(cè)PKC激活的FRET技

14、術(shù)檢測(cè)平臺(tái)構(gòu)建成功，其可以作為后續(xù)試驗(yàn)中檢測(cè)PKC激活的有效手段。PTHR穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞在PTH(1-34)的作用下，C/Y值顯著增高，即檢測(cè)到PKC被激活，表明我們成功地構(gòu)建了PTHR穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染CKAR的PTHR穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞細(xì)胞中，阻斷cAMP通路后，GR(1-28)無(wú)法激活PKC，而GR(1-34)仍可激活PKC，nonPLC/PKC通路的激活與PTH的29至34氨基酸片段有關(guān)。在MY1肽作用下，F(xiàn)RET檢測(cè)顯示C/Y值明顯升高，PKC

15、被激活，而PTH(3-34)及空白對(duì)照中，PKC未被激活。在MY1肽刺激使C/Y值明顯升高后，加入PKC阻滯劑后，C/Y值明顯下降，并逐漸降至起始水平。轉(zhuǎn)染CKAR的HEK293細(xì)胞(無(wú)PTHR)在PTH(3-34)或是MY1作用下，C/Y值均未發(fā)生變化，而在加入TPA（PKC特異性激活劑）后，C/Y值明顯升高，PKC被激活。ELISA法檢測(cè)MC3T3-E1經(jīng)各模擬肽作用下cAMP、PLC的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PTH(1-34)組中cA

16、MP、PLC含量明顯高于其它各組，而其它三組之間cAMP含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即MY1肽沒(méi)有激活cAMP、PLC的能力。
　　MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)各PTH模擬肽作用后行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示MY1組CITED1的表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組和PTH(3-34)組，在加入PKC抑制劑Go6983后，CITED1的表達(dá)量明顯下降，與原代成骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中結(jié)果相一致。在成骨基因檢測(cè)中，ALP的表達(dá)量在MY1組明顯高于空白對(duì)照組和PTH(3-3

17、4)組，且在加入PKC抑制劑后，其表達(dá)量明顯下降。
　　結(jié)論:
　　1.原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)成功，經(jīng)基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)與PTH的nonPLC/PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的14條信號(hào)通路。經(jīng)RT-PCR篩選，我們發(fā)現(xiàn)PTH(29-34)蛋白機(jī)構(gòu)域可通過(guò)PKC信號(hào)途徑促進(jìn)CITED1的表達(dá)，介導(dǎo)PTH對(duì)成骨代謝的作用。該途徑不依賴PLC和PKA信號(hào)的激活。
　　2.經(jīng)FRET分析，PTHR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功建立，我們構(gòu)建的MY1肽具

18、有通過(guò)PTHR激活PKC的特性，且不依賴PKA及PLC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。表明MY1為PTH/nonPLC/PKC通路特異性模擬肽。MY1肽的建立為PTH/nonPLC/PKC的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)，據(jù)我們所知，單純具有nonPLC/PKC的信號(hào)特征的PTH模擬肽國(guó)內(nèi)外未有報(bào)道。
　　3.MY1肽促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子CITED1和成骨基因ALP的表達(dá)，表明PTH的nonPLC/PKC通路至少通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子CITED1或成骨基因ALP的表達(dá)量參與骨