蟬翼藤抗風(fēng)濕活性物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究.pdf

1、蟬翼藤是我國(guó)南方地區(qū)廣泛使用的一味傳統(tǒng)植物藥，主要用于治療骨折、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）及各種炎癥。在漫長(zhǎng)的使用歷史中，雖然蟬翼藤的有效性及安全性得到了充分的驗(yàn)證，但現(xiàn)代研究非常匱乏。為推進(jìn)該品種的現(xiàn)代化開發(fā)，獲取新型抗風(fēng)濕有效藥物，對(duì)蟬翼藤抗風(fēng)濕活性物質(zhì)基礎(chǔ)及相關(guān)作用機(jī)制開展研究非常必要。
　　目的:
　　在充分論證蟬翼藤抗風(fēng)濕作用的有效性和可靠性的前提下，對(duì)不同極性萃取部位進(jìn)行體內(nèi)

2、外抗風(fēng)濕活性的篩選及驗(yàn)證，并對(duì)有效部位進(jìn)行成分研究，獲取潛在的活性單體化合物。利用體外細(xì)胞模型，初步闡明活性成分抗風(fēng)濕作用的部分分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.采用佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)小鼠模型研究蟬翼藤水提物和醇提物對(duì)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的治療作用。關(guān)節(jié)炎的臨床表現(xiàn)及嚴(yán)重程度采用多種指標(biāo)綜合評(píng)估，主要包括炎癥受累足足重、病理切片解剖學(xué)特征和免疫器官腫脹程度等。
　　2.蟬翼藤各萃取部位的潛在抗風(fēng)濕活性通過其體內(nèi)外的抗炎、鎮(zhèn)痛及

3、免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行評(píng)估?？寡谆钚栽u(píng)價(jià)采用角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠足腫脹模型，觀察各極性部位對(duì)足腫脹度及PGE2水平的影響。鎮(zhèn)痛活性采用熱板鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)考察。體內(nèi)外的免疫調(diào)節(jié)作用通過小鼠體內(nèi)的碳粒廓清實(shí)驗(yàn)和小鼠脾細(xì)胞體外的轉(zhuǎn)化增殖實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)。
　　3.對(duì)遴選出的潛在抗風(fēng)濕活性部位的體內(nèi)活性驗(yàn)證采用AA大鼠模型實(shí)驗(yàn)完成，具體的治療效果通過以下指標(biāo)綜合評(píng)估:關(guān)節(jié)炎指數(shù)，體重增幅，炎癥足足周，解剖變化，免疫器官腫脹度，血清和（或）肝臟中SOD、GSH

4、、OH、NO、MDA、NAG、SA、ALP、AST、ALT水平，血清中白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)水平和血細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果等。
　　4.有效部位中單體的分離依靠多種色譜方法聯(lián)用完成，采用的主要色譜方法有中壓硅膠柱色譜和LH-20凝膠柱色譜法?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)鑒定依賴多種波譜方法的綜合應(yīng)用。蟬翼藤的脂肪油和揮發(fā)性成分的構(gòu)成分析采用GC-MS法，具體的

5、化合物鑒定采取與內(nèi)建譜庫(kù)及與標(biāo)準(zhǔn)烷烴保留值對(duì)照的方法。
　　5.蟬翼藤中的代表性山酮對(duì)AA小鼠的治療作用采取與上述類似的佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型實(shí)驗(yàn)，主要評(píng)價(jià)內(nèi)容包括臨床觀察指標(biāo)和血清中的標(biāo)志性酶、氧化應(yīng)急水平、組織降解物濃度、促炎細(xì)胞因子水平等。
　　6.蟬翼藤中山酮抗風(fēng)濕機(jī)制研究主要通過觀察1，7-二羥基-3，4-二甲氧基山酮(X-3)對(duì)MH7A細(xì)胞的增殖和促炎細(xì)胞因子分泌的抑制作用來分析，并結(jié)合W-B法和流式細(xì)胞術(shù)分析其對(duì)可

6、能的效應(yīng)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)與生物效應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)性。
　　結(jié)果:
　　1.蟬翼藤的水提物和醇提物均能有效地治療AA，表現(xiàn)為各臨床觀察指標(biāo)的改善和免疫器官腫脹的逆轉(zhuǎn);醇提物的療效相對(duì)于水提物更優(yōu)。
　　2.蟬翼藤的二氯甲烷萃取部位(SID)具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛和免疫抑制活性，是主要的抗風(fēng)濕活性部位。該極性部位對(duì)角叉菜膠導(dǎo)致的小鼠急性足腫脹表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用，同時(shí)能顯著降低炎癥足中PGE2的濃度水平;延長(zhǎng)小鼠對(duì)由熱所致疼痛的反

7、應(yīng)時(shí)間;印度墨水實(shí)驗(yàn)中，觀察到對(duì)小鼠碳粒廓清率的下調(diào)作用;并對(duì)由LPS和Con A誘發(fā)小鼠脾細(xì)胞體外的轉(zhuǎn)化和增殖具有抑制作用。
　　3.SID能對(duì)AA大鼠的炎癥癥狀產(chǎn)生確切的治療作用，體重增幅減小、足腫脹、免疫器官腫大和滑膜組織增生等癥狀均得到有效控制。同時(shí)它對(duì)異常變化的血液生化指標(biāo)和細(xì)胞因子水平(NO，MDA，OH·，SOD，GSH，AST，ALT，ALP，NAG，SA，IL-1，TNF-α，MCP-1和VEGF)等均產(chǎn)生了恢復(fù)

8、性調(diào)節(jié)作用。
　　4.從蟬翼藤的主要活性部位中分離并鑒定了25個(gè)化合物，其中包含12個(gè)已知山酮類化合物及1個(gè)新的山酮，另有6個(gè)化合物為首次從該植物中分離獲取。脂肪油的GC-MS譜圖中，55個(gè)信號(hào)中的34個(gè)被成功鑒定，已鑒定峰面積占總面積97.18％，主要化合物為十六烷酸(36.89％)和十八碳烯酸(31.12％)。從揮發(fā)性成分的48個(gè)信號(hào)中鑒定出29個(gè)化合物，所占總信號(hào)面積達(dá)83.71％，其中主要化合物類型為單萜(23.12％)和

9、脂肪酸(21.70％)。
　　5.所有代表性山酮對(duì)AA小鼠均具有明顯的治療作用，它們可顯著降低血清中促炎因子IL-1、TNF-α、MCP-1和VEGF的水平，并逆轉(zhuǎn)血清和肝臟中MDA、GSH、NAG和SA水平的異常變化。
　　6.X-3通過上調(diào)p38通路對(duì)MH7A細(xì)胞產(chǎn)生周期阻滯作用，進(jìn)而抑制了細(xì)胞的異常增殖;通過下調(diào)JNK通路抑制了細(xì)胞促炎因子IL-1β和IL-6的分泌;通過上調(diào)NF-κB通路產(chǎn)生促凋亡作用，對(duì)細(xì)胞的增殖也

10、起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)論:
　　蟬翼藤具有確切的體內(nèi)抗風(fēng)濕作用，其二氯甲烷部位具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛和免疫抑制活性，且對(duì)AA大鼠具有顯著的治療效果，是潛在的抗風(fēng)濕有效部位。對(duì)該部位的分離主要獲得若干山酮類成分，鑒于其已有活性報(bào)道和其對(duì)AA小鼠產(chǎn)生的直接治療作用，該類成分被認(rèn)為是蟬翼藤中發(fā)揮抗風(fēng)濕作用的重要活性物質(zhì)，其對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用部分地來自于對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞的增殖和促炎因子分泌的抑制作用。在上述過程中，山酮對(duì)MA