人參皂苷Rg3抗黑色素瘤作用機制的研究.pdf

1、目的:
　　黑色素瘤是全世界皮膚腫瘤相關性死亡的主要原因(80％)。它是一種惡性程度較高，臨床預后較差的惡性腫瘤。Ⅳ期黑色素瘤患者的中位生存時間少于1年，而5年生存期少于10％。黑色素瘤的發(fā)病率在世界范圍內逐年增加，它的致死率的增長速度高于其他任何形式的惡性腫瘤。傳統(tǒng)的晚期轉移性惡性黑色素瘤的治療包括:化療（達卡巴嗪、替莫唑胺）、生物治療（干擾素α-2b）及藥物靶向治療（vemurafenib和ipilimumab）等。由于這些治

2、療的腫瘤反應率低，腫瘤耐藥的產生及嚴重的毒副作用而限制了它們的應用。因此，對于黑色素瘤的治療仍然需要尋找新的治療策略，新的靶點及新的治療藥物。
　　人參是一個古老的中草藥，它具有滋補、強心、抗炎、抗腫瘤和免疫刺激的作用。20(R)-人參皂苷Rg3是從人參中提取的單體成分，具有廣泛的藥理學活性和治療作用。報道顯示Rg3在結腸癌、胃癌、乳腺癌及肝癌中具有抑制腫瘤生長的作用;Rg3在前列腺癌和結腸癌中具有增加多西他賽和順鉑化療敏感性的作

3、用;Rg3在肝癌細胞中具有抗腫瘤血管形成和誘導凋亡的作用。目前，參一膠囊（其主要成分為Rg3）已經在中國被批準為治療臨床晚期非小細胞肺癌的輔助藥物。蛋白質轉錄后的修飾與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關，其中乙酰化和糖基化也成為抗惡性黑色素瘤的研究熱點。然而Rg3抗黑色素瘤的作用機制是否與調控蛋白質的乙酰化和糖基化目前還不清楚。
　　乙酰化和去乙?；钦{控基因表達的表觀遺傳學過程。異常的去乙?；?HDACs)的表達與腫瘤的生長、侵襲和轉移密切

4、相關。例如，HDAC6在人類乳腺癌和前列腺癌中過表達，HDAC2在宮頸癌和胃癌中過表達，HDAC8在兒童神經母細胞瘤中過表達。HDAC3的過表達也在許多惡性腫瘤中被報導，如肺癌、結腸癌、胃癌和前列腺癌。有研究認為HDAC3的表達與p53的乙酰化與腫瘤的生長有關。然而Rg3抗惡性黑色素瘤生長的機制是否與調節(jié)HDAC3和p53乙酰化的表達需要進一步探索。
　　蛋白的糖基化在腫瘤病理生理過程中發(fā)揮重要的作用，包括腫瘤增殖、侵襲、血源性轉

5、移和血管形成。巖藻糖基化是蛋白糖基化的一種重要形式。巖藻糖基轉移酶(FUTs)是催化合成巖藻糖的關鍵酶。其中FUT4是FUTs家族的成員之一，是催化合成α1，3-巖藻糖LeY的關鍵酶。文獻報道顯示FUT4在很多腫瘤中過表達，例如在結腸癌、胃癌和肺癌中。過表達FUT4能夠促進細胞的增殖、轉移和抗凋亡。然而Rg3在惡性黑色素瘤生長誘導凋亡中的作用與潛在的調節(jié)FUT4表達與EGFR/MAPK和NF-κB信號通路目前仍不清楚。
　　本研究

6、通過Rg3對HDAC3和FUT4表達調控的研究，分析Rg3在黑色素瘤中抑制腫瘤生長誘導凋亡及其調控的相關信號通路，進一步探討Rg3介導的抗黑色素瘤作用的分子機制，以期為臨床治療黑色素瘤提供科學依據。
　　方法:
　　1、收集2003至2010年在大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科存檔的石蠟組織標本且臨床資料完整的惡性黑色素瘤患者32例。采用免疫組化法測定所有病理標本中HDAC3的表達情況，并對所有病例進行隨訪。分析HDAC3與患

7、者臨床病理特征和預后的相關性。應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，以P＜0.05為顯著性標準。表達的組間差異比較采用x2檢驗;
　　2、利用CCK-8、MTT法及細胞克隆形成實驗分析黑色素瘤細胞的增殖能力;
　　3、利用脂質體瞬時轉染技術將HDAC3 siRNA、FUT4 siRNA轉染至人黑色素瘤細胞中，下調HDAC3和FUT4的表達;
　　4、采用Real-time PCR的方法檢測HDAC3、PCNA、FU

8、T4和p65基因的表達;
　　5、采用Western blot的方法檢測HDAC3、FUT4、LeY、Caspase-3、-8、-9、Bcl-2、Bax、Survivn、NF-κB和EGFR/MAPK信號通路等相關蛋白的表達;
　　6、利用免疫組化和免疫熒光檢測HDAC3、FUT4、PCNA和p65的表達;
　　7、采用流式細胞儀分析細胞周期及細胞凋亡;
　　8、采用凝膠電泳遷移率(EMSA)方法檢測NF-κB與

9、DNA的結合情況;
　　9、使用熒光素酶報告基因檢測p53和NF-κB的活性情況;
　　10、使用染色質免疫共沉淀(ChIP)方法檢測NF-κB與FUT4啟動子區(qū)的結合情況。
　　結果:
　?。ㄒ唬┤藚⒃碥誖g3抑制黑色素瘤的增殖與下調HDAC3，增加p53乙?；南嚓P性研究
　　1、HDAC3過表達與淋巴結轉移及腫瘤分期有關;
　　2、Rg3抑制黑色素瘤的生長;
　　3、Rg3降低HDAC3的

10、表達;
　　4、下調HDAC3表達抑制細胞的增殖;
　　5、Rg3和下調HDAC3的表達增加p53的乙?；娃D錄活性;
　　6、Rg3下調HDAC3改變細胞周期相關蛋白的表達;
　　7、Rg3在體內抑制裸鼠腫瘤的生長。
　?。ǘ┤藚⒃碥誖g3抑制黑色素瘤增殖與下調FUT4/LeY介導的EGFR/MAPK通路的失活的相關性研究
　　1、Rg3抑制A375黑色素瘤細胞的生長;
　　2、Rg3降低F

11、UT4和LeY的表達;
　　3、下調FUT4的表達抑制A375細胞的增殖和減少LeY的表達;
　　4、下調FUT4的表達減少EGFR/MAPK通路的磷酸化;
　　5、Rg3在體內抑制裸鼠腫瘤的生長。
　?。ㄈ┤藚⒃碥誖g3誘導黑色素瘤凋亡與抑制FUT4表達通過靶向調節(jié)NF-κ B/p65信號通路機制的研究
　　1、Rg3抑制人黑色素瘤細胞的增殖;
　　2、Rg3誘導黑色素瘤細胞的凋亡;
　　3

12、、Rg3抑制NF-κB信號通路的活性;
　　4、Rg3下調FUT4的表達抑制NF-κB連接到FUT4啟動子區(qū);
　　5、Rg3誘導凋亡通過抑制NF-κB信號通路及FUT4的下調;
　　6、Rg3抑制黑色素瘤裸鼠腫瘤生長誘導凋亡。
　　結論:
　?。ㄒ唬┤藚⒃碥誖g3抑制黑色素瘤的增殖與下調HDAC3，增加p53乙酰化的相關性研究
　　1、Rg3具有抑制黑色素瘤裸鼠動物模型和黑色素瘤細胞生長的作用;

13、r>　　2、Rg3下調HDAC3表達具有劑量和時間的依賴性;
　　3、使用siRNA或HDAC3潛在的抑制劑(MS-275)，下調HDAC3表達抑制黑色素瘤細胞的增殖;
　　4、Rg3抑制黑色素瘤增殖通過抑制HDAC3的表達增加p53的乙酰化和轉錄活性。
　?。ǘ┤藚⒃碥誖g3抑制黑色素瘤增殖與下調FUT4/LeY介導的EGFR/MAPK通路失活的相關性研究
　　1、Rg3抑制黑色素瘤的生長與下調FUT4/Le

14、Y有關;
　　2、巖藻糖基轉移酶FUT4與調控的糖抗原LeY表達有關;
　　3、Rg3抑制黑色素瘤增殖通過抑制FUT4/LeY表達及其下游的EGFR/MAPK信號通路。
　?。ㄈ┤藚⒃碥誖g3誘導黑色素瘤凋亡與抑制FUT4表達通過靶向調節(jié)NF-κB/p65信號通路機制的研究
　　1、Rg3具有抑制黑色素瘤裸鼠動物模型和黑色素瘤細胞生長，誘導凋亡的作用;
　　2、Rg3誘導細胞凋亡通過下調NF-κB信號通路