維生素D及其受體對RIP1的調控作用研究.pdf

1、前言：
　　受體相互作用蛋白(Receptor Interacting Protein，RIP)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以調節(jié)核因子κB的活性，是壞死信號通路中關鍵的調控因子，決定細胞生存和死亡的交叉點。目前發(fā)現(xiàn)，RIP家族成員RIP1在細胞凋亡、細胞存活及細胞程序性壞死等信號傳導中起著關鍵的作用，而其功能受熱休克蛋白(HeatShock Proteins，HSPs)，泛素化等的調節(jié)。維生素D(1α，25-dihydrox

2、yvitamin D3)可以影響多種轉錄因子的信號通路，目前已有相當多的流行病學研究結果表明，體內(nèi)維生素D水平與惡性腫瘤的發(fā)生或預后呈負相關。維生素D具有抑制腫瘤等生物學功能，但其具體機制尚不明確。本研究通過檢測維生素D對細胞活性及其對RIP1的mRNA和蛋白表達的影響，發(fā)現(xiàn)維生素D可以抑制RIP1的表達。進一步的研究表明此作用可能與其抑制HSP90和RIP1復合物的形成有關，這一發(fā)現(xiàn)將為維生素D及其受體抑制腫瘤的發(fā)生提供新的理論依據(jù)。

3、
　　目的：
　　一、檢測在小鼠成纖維細胞（mouse fibroblasts cells，L929）和小鼠胚胎成纖維細胞（mice embryonic fibroblasts cells，MEFS）中，維生素D刺激對RIP1的蛋白水平及mRNA水平的表達情況。
　　二、檢測維生素D對HSP90與RIP1相互作用形成復合物的影響，分析維生素D對細胞RIP1表達可能的調控機制，探討維生素D及其受體(Vitamin DRe

4、ceptor, VDR)通過影響RIP1介導的細胞程序性死亡通路，從而調節(jié)細胞存活的可能機制及其治療相關疾病的可能關系。
　　三、探索維生素D對腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF)誘導的細胞死亡的影響。
　　方法：
　　一、應用逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)法和免疫印跡(Westem bl

5、ot，WB)法檢測維生素D對體外培養(yǎng)MEFS、L929細胞RIP1蛋白及mRNA水平的表達影響。
　　二、應用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，IP）法檢測維生素D對RIP1和HSP90相互作用形成復合物的影響。
　　三、應用噻唑藍(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)比色法探索維生素D對TNF誘導MEFS細

6、胞死亡的影響。
　　結果：
　　一、維生素D處理L929細胞，MEFS細胞不同時間，與空白對照組比較，2hRIP1蛋白水平明顯下降。VDR-/-MEFS細胞中RIP1蛋白表達量明顯增加。RIP1mRNA水平的表達隨維生素D刺激時間的增加呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。
　　二、免疫共沉淀實驗中空白對照組HSP90蛋白有表達，對比陰性對照，HSP90與RIP1相互作用，并且維生素D可抑制兩者復合物的形成。VDR-/-MEFS細胞

7、中給予格爾德霉素(geldanamycin，GA)刺激，RIP1的表達量下降。
　　三、以TNFα和蛋白合成抑制劑（Cycloheximide from microbial，CHX）處理MEFS細胞，MTT實驗結果表明維生素D組細胞存活率明顯降低，說明維生素D可以促進TNFα和CHX誘導的細胞死亡。
　　結論：
　　一、維生素D能抑制RIP1蛋白水平及mRNA水平的表達。
　　二、維生素D及受體可能通過調節(jié)HSP