ARFI破壞微泡增強Fe3O4納米粒子在SD大鼠皮下移植瘤靶向遞送的實驗研究.pdf

1、近年來，以納米工程為基礎的腫瘤靶向藥物遞送系統(tǒng)發(fā)展迅速，傳統(tǒng)觀點認為納米微粒能延長在血液循環(huán)中停留時間、逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取，同時由于實體腫瘤較正常組織所具有的血管豐富、血管壁間隙較寬、結構完整性差、淋巴回流缺失等病理結構特點，納米微?？赏ㄟ^實體腫瘤的高通透性和滯留效應(enhanced permeability andretention effect，EPR效應)，從血液循環(huán)外滲至腫瘤組織，理論上，納米顆粒與配體或抗體聯(lián)合可以選擇性輸

2、送化療藥物到達腫瘤靶點，然而靶向納米粒子靜脈注射后在腫瘤組織中的生物分布受到很多因素的影響，如給藥的納米粒子、藥物、藥物測定方法、和其他實驗因素等，實際上腫瘤部位藥物的實際累積量通常小于5％，超過90％的注射藥物在血液循環(huán)中即被清除而并沒有聚集在腫瘤內(nèi)。即使納米顆粒隨血液循環(huán)到達腫瘤部位，由于腫瘤內(nèi)部較周圍組織增高的組織間隙壓力(interstitial fluid pressure，IFP)和更為致密的細胞外基質(zhì)結構（extracel

3、lular matrix，ECM），想要實現(xiàn)腫瘤內(nèi)的高效靶向遞送，納米顆粒必須克服腫瘤微環(huán)境的屏障。
　　研究證明，在培養(yǎng)細胞懸浮液中加入超聲造影劑微泡，在超聲波的輻照下，細胞膜可對大分子暫時開放，隨后閉合，大分子可以進入細胞并被細胞俘獲，這種現(xiàn)象稱為聲孔效應[1-3]，利用聲孔效應可以增加基因轉然效率，導致培養(yǎng)細胞表型改變。聲孔效應是聲空化所伴隨發(fā)生沖擊波、射流對細胞共同作用的結果。體內(nèi)實驗也證明，超聲波觸發(fā)的微泡破裂，可在超聲

4、波輻照的局部使微泡經(jīng)過的微血管通透性發(fā)生短時間一過性增加，標記紅細胞、膠體微粒、質(zhì)粒DNA等可以被投遞到超聲波輻照的局部組織中，利用超聲波靶向微泡破壞((Ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD)可明顯增強大分子物質(zhì)在體內(nèi)的高效靶向投遞。與正常組織不同，腫瘤新生血管不僅數(shù)量增多，而且結構上出現(xiàn)明顯異常，包括血管扭曲、擴張、囊泡化、微血管異常吻合及微血管三維空間分布異常，支持內(nèi)皮細胞

5、的周細胞數(shù)量減少，基底膜變薄、不連續(xù)，血管壁的通透性增加。理論上這些異常改變有利于微粒通過腫瘤血管壁進入腫瘤細胞間隙。
　　傳統(tǒng)UTMD多采用常規(guī)超聲儀，聲場范圍大，經(jīng)體表輻照使聲場內(nèi)所有微泡爆破，并未達到真正意義上的精確定位，聲脈沖輻射成像(acoustic radiation force impulse，ARFI)較多的應用于組織彈性成像，但ARFI作為一種低強度聚焦脈沖，它較UTMD具有的聚焦特性，更小的輻照范圍使之能夠精確

6、定位微泡爆破的范圍。同時研究表明，聲輻射力本身作為一種聲驅(qū)動力，在聲波傳播方向上能主動促使微泡由血管腔內(nèi)向血管壁移動，這對于納米粒子的靶向遞送有著重要的作用。
　　本研究通過制備一種Fe3O4納米粒子，基于實體瘤組織的EPR特征的腫瘤治療策略，實現(xiàn)納米粒子在血液循環(huán)中較高的遞送，同時利用超聲波聯(lián)合微泡造影劑產(chǎn)生的空化效應，達到物理方法開放腫瘤生物學屏障，增加藥物的滲透性達到物理靶向的作用。這種納米粒子結合新型影像技術的物理靶向遞送

7、為腫瘤的靶向治療提供了新的策略和實驗思路。
　　方法及路線:
　　1.制備Fe3O4納米粒子并對其一般性質(zhì)檢測:
　　將所需材料按照一定比例配比，采用高溫水熱法制備Fe3O4納米粒子，調(diào)整各部分材料比例，得到不同大小尺寸的Fe3O4納米粒子，選擇符合實驗需求的Fe3O4納米粒子，用透射電鏡對其進行粒徑大小及形態(tài)學觀察，采用馬爾文激光粒徑儀對其粒徑分布、表面電位進行檢測。
　　2.對制備的Fe3O4納米粒子進行體外

8、磁共振顯影
　　將制備好的Fe3O4納米粒子分散成不同F(xiàn)e濃度的雙蒸水混懸液，并將其重懸于含瓊脂糖凝膠的離心管中，將上述離心管置于管架上采用7.0T MRI掃描，觀察Fe3O4納米粒子體外磁共振顯影效果。
　　3.建立SD大鼠皮下移植瘤模型
　　將Walker256細胞常規(guī)培養(yǎng)于1640完全培養(yǎng)液，在細胞增殖處于對數(shù)生長期時調(diào)整細胞濃度為1×107個/mL備用。大鼠局部用碘伏消毒，將制備的高濃度細胞懸液0.5mL注射于

9、大鼠左后腿皮下，觀察大鼠局部皮膚腫脹呈皮丘狀，接種后第7天觀察，并用于進一步實驗。
　　4.ARFI破壞微泡增強Fe3O4納米粒子在大鼠皮下移植瘤靶向遞送的實驗研究
　　SD大鼠隨機分成6組:(1)單純ARFI輻照組(2)單純MBs組(3) ARFI輻照MBs組(4)單純Fe3O4納米粒子組(5) ARFI輻照Fe3O4納米粒子組(6) ARFI輻照MBs和Fe3O4納米粒子組。
　　處理條件:ARFI輻照條件:低頻脈

10、沖聚焦超聲探頭輻照腫瘤部位，間隔5s，累計輻照5min; MBs:經(jīng)大鼠尾靜脈推注經(jīng)生理鹽水稀釋后的微泡0.2mL; Fe3O4納米粒子:經(jīng)大鼠尾靜脈推注劑量為5mg/kg Fe3O4納米粒子。
　　不同處理組給予相應處理，將處理后的SD大鼠腫瘤部位行MRI掃描觀察腫瘤組織信號變化;處死SD大鼠，取組織標本行病理學分析。
　　結果及結論:
　　1.制備的Fe3O4納米粒子形態(tài)規(guī)則，粒徑分布均勻，具有磁共振顯像功能。

11、r>　　2.SD大鼠腫瘤組織普魯士藍染色結果為單純ARFI輻照組、單純MBs組、ARFI輻照MBs組均未見藍染顆粒，單純Fe3O4納米粒子組、ARFI輻照Fe3O4納米粒子組、ARFI輻照MBs和Fe3O4納米粒子組均可見點狀藍染顆粒。其中ARFI輻照MBs和Fe3O4納米粒子組藍染顆粒計數(shù)明顯多于其余兩組(P＜0.05)，其中ARFI+MBs+Fe3O4組納米粒子藍染顆粒最多，藍染顆粒多分布在血管周圍。
　　3.SD大鼠腫瘤部位

12、磁共振成像結果為處理前腫瘤在T2*序列上呈現(xiàn)不均勻高信號，部分內(nèi)部可見點狀低信號，考慮為腫瘤局部的壞死灶，單純ARFI輻照組、單純MBs組、ARFI輻照MBs組處理前后均未見明顯信號改變，單純Fe3O4納米粒子組、ARFI輻照Fe3O4納米粒子組、ARFI輻照MBs和Fe3O4納米粒子組經(jīng)相應處理后T2*WI均可見腫瘤內(nèi)部低信號部分增加。
　　ARFI輻照MBs能夠有效地提高Fe3O4納米粒子在SD大鼠皮下移植瘤組織的分布，增強F