夏氏瘧原蟲感染小鼠中調(diào)節(jié)性B細胞數(shù)量和表型的研究.pdf

1、瘧疾是由瘧原蟲通過媒介昆蟲傳播感染引起的嚴重威脅人類生命的感染性疾病，已成為全球最嚴重的三大公共衛(wèi)生問題之一。目前尚未有應(yīng)用于臨床的有效瘧疾疫苗。因此，抗瘧疾疫苗的研制成為了當今的重點課題，而瘧原蟲感染宿主機體應(yīng)答的免疫學、分子生物學等綜合研究是其重要前提。
　　瘧疾與其他大多數(shù)感染性疾病一樣，需要通過免疫效應(yīng)機制對其控制和消除。在感染早期，以IFN-γ為主導的Th1型細胞免疫應(yīng)答遏制原蟲的爆發(fā)性增殖。隨之，有Th2型細胞輔助B細

2、胞產(chǎn)生特異性抗體，能夠有效清除瘧原蟲，防止復發(fā)和再燃。適時適度的的Th1/Th2應(yīng)答具有保護作用，而過度或不恰當?shù)膽?yīng)答可能導致病理性損傷。
　　調(diào)節(jié)性B(Bregs)是能夠分泌Th2型細胞因子IL-10的B細胞，有研究發(fā)現(xiàn)伯氏瘧原蟲感染能夠誘導小鼠脾臟產(chǎn)生Bregs，能夠有效抑制病理性免疫應(yīng)答導致的腦瘧從而延長小鼠存活時間。但調(diào)節(jié)性B細胞在抗瘧疾保護性免疫應(yīng)答中的作用和地位并不清楚。研究顯示，瘧疾保護性免疫應(yīng)答中Th1應(yīng)答向Th2

3、型應(yīng)答的轉(zhuǎn)換需要B細胞參與，在重癥瘧疾貧血患兒體內(nèi)B細胞數(shù)量和表型存在異常。由此推測，瘧原蟲感染可誘導Bregs活化，在保護性和病理性應(yīng)答的平衡中發(fā)揮重要而獨特作用。
　　目的：
　　C57BL/6小鼠可以產(chǎn)生較強烈的Th1型應(yīng)答，而BALB/c小鼠則偏向Th2型應(yīng)答，因此我們建立了不同P.c chabadui AS感染鼠瘧模型。本研究利用夏氏瘧原蟲感染的C57BL/6和BALB/c小鼠模型，通過檢測Bregs在不同初次和再

4、次感染中的應(yīng)答模式、與Th1/Th2極化的關(guān)系，以及表型變化，揭示Bregs在瘧疾免疫應(yīng)答中的作用。
　　方法：
　　1、實驗動物和瘧原蟲
　　6～8周雌性C57BL/6與BALB/c小鼠，SPF級，由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供（許可證編號:SCXK京200420001）。致死型夏氏瘧原蟲(Plasmodium chabadudi chabadui AS，P.c chabadui AS)液氮凍存，由BALB/c小

5、鼠周期復蘇傳代。
　　2、實驗動物感染
　　瘧疾感染:C57BL/6與BALB/c每只小鼠經(jīng)腹腔感染1×106P.c chabadui AS寄生紅細胞(pRBC)。P.c.AS感染后第3天開始，尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，動態(tài)監(jiān)測瘧原蟲血癥水平、生存率。
　　3、流式細胞術(shù)
　　FACS檢測小鼠脾細胞中產(chǎn)生IL-10的CD11b、CD19及CD3的水平，并檢測分泌IL-10的CD19細胞中CD1d、

6、CD5、IgM、IgD、IgG、B220及CD138等的表達量。
　　4、Realtime PCR檢測細胞因子
　　TRIzo1勻漿提取脾臟組織mRNA，反轉(zhuǎn)錄為eDNA后，保存于-20℃作為Realtime PCR的模板，將RPS17作為內(nèi)參基因，檢測IL-I0基因表達水平。
　　5、統(tǒng)計學處理
　　使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，標本采用獨立樣本t檢驗對數(shù)據(jù)做統(tǒng)計分析。P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計

7、學意義。
　　結(jié)果：
　　1、P.c chabadui AS感染小鼠原蟲血癥水平和生存率
　　C57BL/6與BALB/c小鼠經(jīng)腹腔感染1×106 P.c chabaudi AS寄生的紅細胞(pRBC)后，于感染后第4天在外周血可見瘧原蟲感染的紅細胞，隨后紅細胞感染率迅速上升。在感染后第8天紅細胞感染率達到峰值(36％)。隨后C57BL/6小鼠的感染率開始迅速下降，并在感染后第13天被基本清除，而BALB/c小鼠的感染

8、率下降緩慢，在感染后第9天開始出現(xiàn)死亡，感染后第11左右基本全部死亡。
　　2、P.c chabadui AS感染小鼠脾細胞IL-10的分泌水平及來源
　　C57BL/6小鼠脾組織中IL-10 mRNA水平及分泌IL-10細胞的數(shù)量在感染后第8天達到峰值，BALB/c小鼠在感染后第5天達到峰值。分泌IL-10細胞的數(shù)量約占小鼠脾細胞總數(shù)的5％，并隨小鼠的原蟲血癥的升高而升高。
　　C57BL/6和BALB/c小鼠脾淋巴

9、細胞中分泌IL-I0的細胞主要為CD3+T細胞和CD19+B細胞。C57BL/6小鼠在感染后第8天CD19+IL-10+B細胞數(shù)量達到峰值，占脾淋巴細胞總數(shù)的1.9％，在分泌IL-10細胞中的比重為40％。CD3+IL-10+T細胞數(shù)量的峰值出現(xiàn)在感染后第5天，占脾淋巴胞總數(shù)3％。BALB/c小鼠CD19+IL-10+B細胞和CD3+IL-10+細胞的峰值出現(xiàn)在感染后第5天，分別占脾淋巴細胞總數(shù)的3.4％和2.6％，其中CD19+B細胞

10、占分泌IL-10細胞的50％，且在感染初期CD19+IL-10+B細胞數(shù)量多于CD3+IL-10+細胞數(shù)量。
　　3、在P.c chabadui AS感染模型中B10細胞亞群的變化
　　B10細胞表型為CD19+CD5+CD1dhi，被認為是表達IL-10主要調(diào)節(jié)性B細胞亞群。在本實驗模型中發(fā)現(xiàn)，在感染初期CD19+IL-10+細胞中只有部分表達CD5及CD1d，感染后第8天，脾細胞中CD19+IL-10+細胞約占脾細胞總數(shù)

11、的2％，其中主要為CD5ˉCD1dˉBregs。
　　4、P.c chabadui AS感染第8天后小鼠脾淋巴細胞中CD19+IL-10+非B10細胞表型特點
　　在感染后第8天，小鼠脾淋巴細胞中CD19+IL-10+為非B10細胞，其高表達IgG和B220（表達量為80％），低表達IgM和IgD（表達量為20％），不表達CD5、CD1d和CD138。
　　5、二次感染P.c chabadui AS小鼠脾淋巴細胞中CD

12、19+ IL-10+細胞的數(shù)量和表型特點
　　在C57BL/6小鼠二次感染P.c chabadui AS中發(fā)現(xiàn)CD19+IL-10+B細胞數(shù)量的峰值出現(xiàn)在感染后第5天，相較首次感染有所提前。并且小鼠脾淋巴細胞中CD19+IL-10+B細胞的表型與初次感染相似，均為非B10的IgG+Bregs細胞。
　　結(jié)論：
　　1、 P.c chabadui AS感染后小鼠脾細胞中IL-10的分泌水平明顯升高;
　　2、Bre