NT-proBNP單克隆抗體的研制及ELISA定量檢測方法的建立.pdf

1、目的：心衰是導致多數心臟病人死亡的最終發(fā)展階段，嚴重影響了患者的生命健康。因此，如何在心衰發(fā)病的早期及時診斷、指導臨床醫(yī)生盡早開展抗心衰的治療一直是人們研究的熱點。研究發(fā)現：N端前腦鈉肽（NT-proBNP）是判定心衰進程、發(fā)展的主要標志物，其含量變化可敏感及特異地反應心室功能的變化和心臟功能的損傷及損傷程度。目前國內關于NT-proBNP檢測產品技術的研究處于起步階段，所需抗體等主要材料大多依賴進口。因此，本研究擬通過制備抗NT-pr

2、oBNP單克隆抗體、并以此為基礎建立一種檢測人血清中N端前腦鈉肽含量的雙抗體夾心ELISA檢測方法來推動國內該疾病檢測方法的進步。
　　方法：1.將 NT-proBNP抗原免疫 BABL/c小鼠，經細胞融合、陽性細胞株篩選制備NT-proBNP單克隆抗體。用分別與OVA耦聯的線性表位片段18～38、35～50、55～72篩選確定所得單抗針對的線性表位，并通過間接ELISA特異性分析及亞型分析方法對所得單抗進行特異性及亞型鑒定。

3、r>　　2.通過雙抗體夾心ELISA法對所得單抗篩選獲取配對單抗，并以此為基礎通過包被與封閉條件、包被與酶標抗體工作濃度、反應模式、室內質控品及標準品的建立、線性范圍、批內、批間精密性、回收率、干擾因素等方面的研究，建立人N端前腦鈉肽ELISA定量檢測方法。
　　結果：1.共獲得15株單克隆抗體。單抗亞型及表位鑒定顯示：10株為IgG1亞型，這10株中有5株針對18～38線性表位，2株抗體針對35～50線性表位，3株抗體針對55～

4、72線性表位，且與心衰相關標志物均無交叉反應。其中，5E10和5G5抗體配對。另外5株不是針對特異性表位抗原的單克隆抗體，舍棄。
　　2.本實驗建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法的條件為：包被抗體濃度為4μg/mL，酶標稀釋倍數為1:3000；反應模式為兩步法反應模式：37℃樣本孵育30min，酶標孵育30min，顯色20 min。
　　3.建立的NT-proBNP檢測方法：線性范圍為50～500 pg/mL，批內及批間精密

5、性分別為2.3％和3.4%。低值、中值及高值的回收率分別為93.7%、97.2%、101.2%。干擾因子脂血、黃疸及低濃度溶血等對試驗結果無影響。用200份臨床血清測試，該試劑臨床總符合率為96.9%，用48份與國外試劑盒平行測試，結果表明兩者具有相關性，回歸方程：Y=0.8017X+188.3，R2=0.9027。
　　結論：1.利用單抗制備技術成功制備出10株NT-proBNP單抗，并篩選出1對最優(yōu)的NT-proBNP檢測用配