GEBP11多功能磁性納米探針對動脈斑塊及腫瘤血管新生的多模態(tài)分子影像研究.pdf

1、背景：
　　惡性腫瘤和動脈粥樣硬化是世界范圍內(nèi)危害人類健康的主要疾病，發(fā)病率均逐年上升，對其發(fā)病機制和疾病特征的研究有助于改進診斷方法和提高療效。近年來，大量研究證實：血管新生廣泛參與腫瘤和動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，且可能作為核心事件發(fā)揮關鍵作用。腫瘤生長和轉(zhuǎn)移依賴性的需要血管生成，抗血管治療可使腫瘤體積顯著縮小，延長患者生存時間。發(fā)生于動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的血管新生可顯著增加斑塊的易損性，而抗血管治療能縮小斑塊面積，增加其穩(wěn)定性。常

2、規(guī)影像學技術不能滿足檢測腫瘤和動脈斑塊中血管新生的臨床需求，嘗試新的成像靶點，改進成像方法具有重要的現(xiàn)實意義。分子影像學是一門新興的具有廣闊臨床應用前景的學科，它可以結(jié)合多種成像模式在活體狀態(tài)對疾病進程中的病理性分子進行定性和定量研究。選擇特異的分子探針進行各種模態(tài)的分子成像，有助于對疾病做出早期診斷。
　　GEBP11是本課題組利用噬菌體隨機肽庫技術，基于人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothe

3、lial cell,HUVEC）與腫瘤細胞共培養(yǎng)模型，經(jīng)多輪篩選獲得的環(huán)狀九肽。我們前期研究證實，GEBP11與正常HUVEC親合力不高，對經(jīng)過腫瘤細胞刺激，處于活化狀態(tài)的共培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（Co-cultured human umbilical vein endothelial cell,Co-HUVEC）表現(xiàn)出很強的親和力，具有特異性靶向新生血管的能力。進一步研究發(fā)現(xiàn)，GEBP11在放射性核素131I標記后，既可作為影像學探針對

4、活體胃癌血管進行切倫科夫和單光子發(fā)射計算機斷層掃描(single photon emission computed tomography,SPECT)雙模態(tài)分子成像，又可作為放射性藥物發(fā)揮治療效用。盡管GEBP11具有易于合成修飾、組織穿透力強、免疫原性低、造價低廉等優(yōu)點，但與抗體等大分子蛋白相比，其在體內(nèi)血漿清除率高、半衰期短，需通過化學方法改善其藥代動力學表現(xiàn)以提升應用價值。
　　磁性納米顆粒(magnetic nanopar

5、ticles,MNPs)以其獨特的物理化學性質(zhì)，可作為優(yōu)良的診斷治療工具應用于生命醫(yī)學領域。經(jīng)二巰基丁二酸(dimercaptosuccinic acid,DMSA)等生物相容性材料表面修飾后，將粒徑大小適宜的MNPs與肽、抗體等生物活性分子連接，可顯著延長后者在血液循環(huán)中的停留時間，改善其生物學分布。與此同時，MNPs自身就是磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)的對比劑，又可作為載體連接熒光染料或

6、放射性核素，將多種成像模態(tài)融合。此外，MNPs還可用于攜帶化療藥物、放射性核素、微小核糖核酸(MicroRNA,miRNA)等發(fā)揮治療作用。
　　因此，我們設想構建一種由GEBP11來特異性靶向新生血管，MNPs作為多功能載體，適用于MRI、熒光成像（fluorescence imaging,FI）和正電子發(fā)射計算機斷層掃描(positron emission tomography,PET)等多種影像學平臺的智能磁性納米探針成像系

7、統(tǒng)，并評估將其用于腫瘤和動脈粥樣硬化斑塊多模態(tài)分子成像的可行性。
　　研究目的：
　　1.構建具有新生血管靶向能力，可用于熒光和MR雙模態(tài)分子成像的磁性納米顆粒Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs，對其進行表征，體外研究其對Co-HUVEC的靶向能力和細胞毒性。
　　2.建立荷瘤裸鼠模型，通過熒光及磁共振成像技術在體評估Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs對腫瘤新生血管的fluorescence/MR雙

8、模態(tài)分子成像的應用價值。
　　3.構建具有新生血管靶向并具備PET或MR分子成像能力的磁性納米顆粒NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs，進行探針的物理化學表征，體外研究確定其對Co-HUVEC的靶向能力和分析細胞毒性。創(chuàng)建68Ga-NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs和GEBP11-DMSA-MNPs對兔動脈粥樣硬化斑塊中新生血管的PET或MR分子成像方法，為易損斑塊的識別提供無創(chuàng)影像手段。
　　研究方法：

9、>　　1.在含有油酸的有機溶劑中熱分解乙酰丙酮鐵，獲得油性包覆的疏水MNPs，將其與DMSA進行表面配體交換反應，獲得水溶性單分散DMSA-MNPs。使用透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)、動態(tài)光散射(dynamic light scattering,DLS)、振動樣品磁強計(vibrating sample magnetometer,VSM)對其進行表征。
　　2.在1-(

10、3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC)和氮-羥基丁二酰亞胺（N-hydroxysuccinimide,NHS)催化下，通過縮合反應將GEBP11和Cy5.5連接到DMSA-MNPs上，并使用TEM、DLS、VSM對Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs進行表征。
　　3.在EDC和NHS催化下，通過縮合反應將GEBP11和

11、螯合劑NOTA連接到DMSA-MNPs上，使用TEM和DLS對NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs進行表征。
　　4.在體外對濃度梯度的Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs分別進行fluorescence/MR成像，鑒定其光學和磁學特征。
　　5.將Co-HUVEC與Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs共孵育12小時，使用普魯士藍染色、激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning

12、 microscope，CLSM)檢測Co-HUVEC對MNPs的攝取。
　　6.將NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs與Co-HUVEC共培養(yǎng)24h，普魯士藍檢測細胞對其攝取，流式細胞儀(flow cytometry,FCM)檢測其凋亡和細胞周期。
　　7.制備裸鼠皮下胃腺癌荷瘤模型，尾靜脈注射Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs探針，在不同時間點進行熒光和 MR成像，分析其在體靶向腫瘤血管的能力，觀察其組織

13、器官分布情況。對腫瘤切片行普魯士藍和CD31免疫組化染色，以明確納米顆粒在腫瘤組織中的定位。
　　8.制作球囊損傷腹主動脈合并高脂飲食喂養(yǎng)誘發(fā)新西蘭兔動脈粥樣硬化模型，通過超聲和血管內(nèi)超聲（intravenous ultrasound，IVUS）觀察斑塊形成，組織學染色鑒定斑塊成分。
　　9.將放射性核素68Ga螯合到NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs上，耳緣靜脈注射68Ga-NOTA-GEBP11-DMSA-MNP

14、s后PET成像。注射GEBP11-DMSA-MNPs并于注射前后4小時行MR成像。取標本行普魯士藍染色，檢測斑塊組織中的納米顆粒。
　　結(jié)果：
　　1.成功合成了平均粒徑10nm左右，大小均一，平均水合粒徑63.2±4.1nm的DMSA-MNPs。其飽和磁化強度為62.7emu/g，可在水溶液中長期保存，無聚集和沉淀。
　　2.連接GEBP11和Cy5.5后，Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs的平均水合尺寸增

15、加到82.8±6.5nm，飽和磁化強度減少為50.3emu/g，在水溶液中顆粒分散性穩(wěn)定。
　　3.TEM顯示，NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs的鐵核心平均粒徑大約12nm，粒徑分布較為均一，水合尺寸大約143nm，飽和磁化強度49.7emu/g，可在溶液中保持穩(wěn)定。
　　4.隨著Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs濃度增加，磁共振T2弛豫時間縮短，熒光信號增強，表現(xiàn)為磁共振T2加權圖像逐漸變暗，而熒光圖像

16、逐漸變亮，信號變化與探針濃度線性相關。激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)被細胞內(nèi)化的Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs主要位于胞漿。
　　5.將Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs與內(nèi)皮細胞共孵育12小時后，內(nèi)皮細胞的磁共振T2弛豫時間縮短，熒光信號增強普魯士藍染色顯示。與非GEBP11靶向組相比，Co-HUVECs對Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs攝取顯著增多。
　　6.與無關對照肽組相比，Co-HUVEC

17、對NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs攝取顯著增加。流式細胞檢測結(jié)果證實，與正常細胞相比，攝取NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs后Co-HUVEC的凋亡和細胞周期無明顯變化。
　　7.活體熒光成像顯示，荷瘤裸鼠尾靜脈注射Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs，腫瘤組織在注射后24小時明顯顯像，其熒光信號在注射后36小時顯著強于其它器官，且洗脫相對緩慢。磁共振T2加權像成像結(jié)果顯示，與注射Cy5.5-GEBP11

18、-DMSA-MNPs前相比，腫瘤部位信噪比在注射后24小時和36小時分別平均降低約18.3％和23.7%。普魯士藍和CD31免疫組化染色證實，Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs特異性蓄積于腫瘤新生血管。
　　8.球囊損傷合并高脂飲食喂養(yǎng)12周成功誘導新西蘭兔腹主動脈斑塊形成。
　　9.PET/CT成像結(jié)果顯示，68Ga-NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs可被腹主動脈斑塊攝取。磁共振成像顯示，GEBP11-D

19、MSA-MNPs注射后4小時斑塊組織T2加權像信噪比降低約19.3%。普魯士藍和CD31染色證實GEBP11-DMSA-MNPs特異性蓄積于斑塊新生血管。
　　結(jié)論：
　　通過本課題的研究，我們成功制備了具有新生血管靶向性的多功能磁性納米顆粒，在體內(nèi)和體外證實GEBP11靶向的DMSA-MNPs可特異性的對共培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞有高親和力。Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs可用于Fluorescence/MR雙模態(tài)成像