長春花轉錄組與萜類吲哚生物堿代謝途徑研究.pdf

1、長春花是抗腫瘤藥物長春堿和長春新堿的唯一植物來源，也是研究萜類吲哚生物堿(TIA)生物合成與調控的模式物種。本研究分別利用Illumina二代測序技術和PacBio三代測序技術對長春花的葉、花和根的轉錄組進行了測序和分析。通過Illumina測序共得到140，787，121條短reads，經de novo拼接獲得191，167條unigenes，平均長度674bp?；蜃⑨尠l(fā)現了許多參與不同生物學過程和具有不同功能的基因，56.12％的

2、基因在與7大數據庫的比對中顯示出同源性。GO分類鑒定出261個與次生代謝有關的基因，KOG分類鑒定出1809個與次生代謝合成、轉運和分解有關的基因，KEGG注釋鑒定出604個與萜類合成有關的基因及12個與吲哚生物堿合成有關的基因。差異表達分析結果顯示，大多數TIAs途徑相關基因在根和葉中的表達量較高，而文多靈途徑的特有基因則在地上部分具有較高的表達量。因此，根據與已知基因的共表達原理，篩選出可能參與TIAs生物合成的8個P450候選基因

3、和5個功能基因。三代測序共獲得786，008條長reads，其中花264，553條、根262，140條、葉259，315條。經數據處理，得到全長轉錄本（full-length reads）378，581條（花:123，665條、根:120，510條、葉:134，406條），非全長轉錄本（non-full-length reads）311，081條（花:105，613條、根:106，459條、葉:99，009條）。通過比對全長轉錄本序列，

4、分析轉錄因子及已知的長春花TIAs途徑催化酶編碼基因，發(fā)現了一些可能的可變剪切形式，提示可變剪切可能參與TIAs生物合成途徑的調控。采用不同平臺進行的大規(guī)模轉錄組測序為研究長春花特殊的次生代謝產物合成途徑提供了豐富的數據資源，PacBio三代測序技術在讀長上的優(yōu)勢也使得分析可變剪切及探究可變剪切對TIAs途徑相關基因表達調控的影響成為了可能。
　　本研究還初步探索了通過在釀酒母中重構TIAs合成途徑生產TIAs的可行性。首先通過轉

5、錄組數據分析發(fā)現釀酒酵母稀有密碼子在長春花基因中的使用頻率偏低，推測長春花基因適合在釀酒酵母中進行表達。克隆了10個已知的環(huán)烯醚萜途徑催化酶基因，經序列比對發(fā)現，除CPR、DLGT、IRS和LAMT存在個別堿基的差異外，其余序列均與GenBank序列完全一致。采用SOE-PCR法構建催化環(huán)烯醚萜途徑前兩步反應的GES、G10H和CPR表達模塊，通過酵母體內重組方法構建三元表達載體，建立從元件選擇、模塊構建到多模塊體內重組的技術流程，為實