消痰散結(jié)方抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、背景:全球范圍內(nèi)，結(jié)腸癌每年導(dǎo)致約69萬人死亡。盡管近年來手術(shù)和放化療等治療方法的進(jìn)展大大提升了患者的生存幾率，但現(xiàn)行治療方法的有效率僅為50％左右，進(jìn)展期患者的預(yù)后更加堪憂，最終結(jié)腸癌的總死亡率仍高達(dá)40％。
　　腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是多因素導(dǎo)致的，近年來越來越多的證據(jù)支持腫瘤干細(xì)胞理論，認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生進(jìn)展的重要原因之一。腫瘤干細(xì)胞是指腫瘤內(nèi)極小部分的細(xì)胞亞群，具有自我更新、形成異質(zhì)性亞群，并形成腫瘤的能力，它已經(jīng)在腸

2、癌、胃癌、乳腺癌等多種實(shí)體腫瘤中被發(fā)現(xiàn)。腫瘤干細(xì)胞具有自我更新、無限增殖、高致瘤性、強(qiáng)耐藥性等多種生物學(xué)特性，它可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等各種惡性行為的源頭。因此，研究者提出——應(yīng)將抗腫瘤干細(xì)胞作為新的抗腫瘤策略。
　　Wnt/β-catenin信號(hào)通路是參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的重要通路，它的激活也是維持腫瘤干細(xì)胞“干性”并促成腫瘤發(fā)生、增殖所必需的。其具體機(jī)制可能涉及其下游相關(guān)靶基因的上調(diào)，如調(diào)控細(xì)胞周期、增殖的Cyclin

3、 D1、c-Myc，凋亡抑制基因Survivin等等;另外，通路的關(guān)鍵蛋白β-catenin在結(jié)腸癌干細(xì)胞中高表達(dá)，β-catenin入核后形成的β-catenin/TCF復(fù)合物可以直接調(diào)控多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Nanog的表達(dá)，這可能是Wnt/β-catenin通路維持干性的重要機(jī)制之一;Wnt/β-catenin信號(hào)激活后，結(jié)腸癌干細(xì)胞的克隆能力和致瘤能力也明顯增強(qiáng)。因此調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性可能是抗腫瘤干

4、細(xì)胞過程中非常重要的一環(huán)。
　　目前尚缺乏對(duì)腫瘤干細(xì)胞有特異性作用的藥物，腫瘤干細(xì)胞對(duì)放、化療等不敏感，常規(guī)的治療方法能夠消滅大多數(shù)腫瘤細(xì)胞，但幸存的耐藥腫瘤干細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)，表現(xiàn)為腫瘤的體積雖然縮小了，但腫瘤發(fā)展的進(jìn)程并未被阻止。在此困境前，許多研究者將目光投向天然藥物。
　　中藥在我國臨床實(shí)踐中被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤治療，近期一些中藥提取物如姜黃素、白藜蘆醇等陸續(xù)被報(bào)道具有抗腫瘤干細(xì)胞的功效。我科魏品康教授致力于治療消

5、化道腫瘤數(shù)十年，經(jīng)驗(yàn)方“消痰散結(jié)方”在臨床實(shí)踐中獲得較好療效，能夠提高中晚期消化道腫瘤患者的生存質(zhì)量并延長其生存期;課題組前期工作基礎(chǔ)表明，消痰散結(jié)方能夠在體內(nèi)外抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，并對(duì)CD44陽性為表型的胃癌干細(xì)胞的生長有抑制作用。因此推測(cè)，靶向抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞可能是消痰散結(jié)方抗結(jié)腸癌的機(jī)制之一。基于此，本課題立足于結(jié)腸癌干細(xì)胞的增殖和致瘤能力，力求探索中藥抗腫瘤干細(xì)胞的可能機(jī)制。
　　目的:首先，富集結(jié)腸癌干細(xì)胞，鑒定

6、其體外增殖能力和體內(nèi)致瘤能力，觀察結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物和Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá);第二、體外和體內(nèi)兩方面觀察消痰散結(jié)方對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖的抑制作用，及其對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響;第三、基于Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控作用探索消痰散結(jié)方可能的作用機(jī)制。
　　方法:
　　第一部分結(jié)腸癌干細(xì)胞的富集與鑒定
　　人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株穩(wěn)定傳代后，在無血清懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)成球以富集結(jié)

7、腸癌干細(xì)胞;通過CCK-8細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)，比較親代和球體細(xì)胞的體外增殖能力;將數(shù)量為1萬、5萬、10萬、50萬、100萬和500萬的親代細(xì)胞和球體細(xì)胞分別移植至6只裸鼠肩背部皮下，觀察成瘤情況，比較二者的體內(nèi)致瘤能力;通過免疫熒光和RT-PCR實(shí)驗(yàn)比較球體細(xì)胞和親代細(xì)胞中多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Nanog的表達(dá);通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)親代細(xì)胞和球體細(xì)胞中結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平的的差異。
　　第二部分結(jié)腸

8、癌干細(xì)胞Wnt/β-catenin通路相關(guān)因子的表達(dá)
　　通過WB實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)球體細(xì)胞和親代細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵蛋白β-catenin、TCF4、c-Myc、Survivin的表達(dá);通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，比較Wnt/β-catenin通路相關(guān)配體、受體的mRNA表達(dá)差異。
　　第三部分消痰散結(jié)方對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞的體外作用及相關(guān)機(jī)制
　　消痰散結(jié)方水提物制備凍干粉末，溶解在細(xì)胞培養(yǎng)基中，以備體外干預(yù)細(xì)胞

9、使用。體外通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)消痰散結(jié)方對(duì)親代細(xì)胞和球體細(xì)胞增殖的抑制作用;5-乙炔基-2'-脫氧尿苷(Edu)滲入實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢驗(yàn)消痰散結(jié)方作用后細(xì)胞的增殖能力;消痰散結(jié)方預(yù)處理親代HCT116細(xì)胞72h后，觀察其在無血清懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中的成球情況;流式檢測(cè)細(xì)胞周期;AnnexinⅤ-PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　消痰散結(jié)方作用于球體細(xì)胞72h后，WB和RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Nanog表達(dá)的變

10、化;qRT-PCR檢測(cè)結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物mRNA表達(dá)的變化;WB檢測(cè)Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白β-catenin、TCF4、c-Myc、Survivin、GSK3β和Akt表達(dá)的變化;qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Wnt/β-catenin通路相關(guān)配體、受體mRNA表達(dá)的變化;WB檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控蛋白p21、CyclinA2、CyclinB1、 CyclinD1、CDK1、CDK2和細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)控蛋白Caspase3、Casp

11、ase7、Bax、Bcl-2表達(dá)的變化。
　　第四部分消痰散結(jié)方對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞的體內(nèi)作用及相關(guān)機(jī)制
　　球體細(xì)胞接種于裸鼠肩背部皮下，造模成功后隨機(jī)分入各組，各組裸鼠給予不同濃度的消痰散結(jié)方灌胃，每周測(cè)量裸鼠體表移植瘤大小和裸鼠體重，連續(xù)飼養(yǎng)4周后，處死裸鼠并剝離瘤塊稱重;球體細(xì)胞接種于裸鼠肩背部皮下后，予高劑量消痰散結(jié)方灌胃，觀察荷瘤鼠生存期。對(duì)各組瘤塊組織通過WB和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox

12、2、Nanog表達(dá)的變化; qRT-PCR檢測(cè)結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物mRNA表達(dá)的變化;WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白β-catenin、TCF4、c-Myc的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　第一部分結(jié)腸癌干細(xì)胞的富集與鑒定
　　親代HCT116細(xì)胞在無血清懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中穩(wěn)定形成細(xì)胞球體;球體細(xì)胞的體外增殖能力強(qiáng)于親代細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體內(nèi)皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)中，親代細(xì)胞最少數(shù)量50萬形成肉眼可見瘤，6只裸鼠中

13、成瘤2只;數(shù)量達(dá)100萬和500萬時(shí)，6只裸鼠都致瘤成功。球體細(xì)胞最少數(shù)量5萬形成肉眼可見瘤，6只裸鼠中成瘤1只;數(shù)量達(dá)至50萬、100萬和500萬時(shí)，6只裸鼠都體內(nèi)致瘤成功。動(dòng)物連續(xù)飼養(yǎng)4周后，球體細(xì)胞所致瘤塊的重量明顯大于親代細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。親代細(xì)胞中多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Nanog有表達(dá)，Oct4和Sox2低表達(dá)或不表達(dá);球體細(xì)胞中，Nanog、Oct4和Sox2的表達(dá)均明顯上調(diào)，相比親代細(xì)胞差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。qRT-PCR法

14、檢測(cè)其他結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平，球體細(xì)胞中，Lgr5、CD44和CD133 mRNA表達(dá)水平明顯強(qiáng)于親代細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　第二部分結(jié)腸癌干細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路相關(guān)因子的表達(dá)
　　球體細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路的關(guān)鍵蛋白β-catenin、TCF4、c-Myc、Survivin表達(dá)均上調(diào)，通路配體Wnt1、Wnt3a、Wnt10b，通路受體Frizzled1、Frizzled

15、2、Frizzled3、Frizzled7，及通路輔助受體LRP5、LRP6的mRNA表達(dá)均高于親代細(xì)胞。
　　第三部分消痰散結(jié)方對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞的體外作用及相關(guān)機(jī)制
　　體外實(shí)驗(yàn)中，消痰散結(jié)方抑制親代HCT116細(xì)胞增殖，作用72h的IC50值為0.9mg/ml;消痰散結(jié)方抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖，抑制作用呈濃度-時(shí)間依賴性，作用72h的IC50值為0.25mg/ml;經(jīng)消痰散結(jié)方預(yù)處理72h的親代HCT116細(xì)胞，在無血清懸浮

16、培養(yǎng)系統(tǒng)中幾乎無法增殖成球，存活細(xì)胞數(shù)明顯減少;Edu滲入法進(jìn)一步證實(shí)消痰散結(jié)方各濃度組均能抑制細(xì)胞增殖能力，處于分裂增殖期的細(xì)胞比例降低。干性標(biāo)志物Nanog、Oct4的表達(dá)在消痰散結(jié)方中、高濃度組下調(diào)，Sox2的表達(dá)在高濃度組下調(diào);其他結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、Lgr5mRNA的表達(dá)水平也下調(diào)。消痰散結(jié)方明顯抑制球體細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路活性，通路關(guān)鍵蛋白β-catenin、TCF4及下游靶基因蛋白c-Myc、Su

17、rvivin表達(dá)明顯下調(diào)，上游機(jī)制涉及兩方面:磷酸化Akt表達(dá)下調(diào)，GSK-3β表達(dá)上調(diào);另外通路配體和受體mRNA的表達(dá)水平不同程度下降。消痰散結(jié)方阻滯球體細(xì)胞周期于S期和G2/M期，相關(guān)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CyclinA2、CyclinB1、CDK、CDK2表達(dá)下調(diào);消痰散結(jié)方同時(shí)激活Caspase3、Caspase7，上調(diào)Bax表達(dá)、下調(diào)Bcl-2表達(dá)，誘導(dǎo)球體細(xì)胞凋亡。
　　第四部分消痰散結(jié)方對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞的體內(nèi)作用及相關(guān)機(jī)制

18、
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，低劑量組未顯示抑制移植瘤生長作用，中、高劑量消痰散結(jié)方能夠抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞移植瘤的生長，瘤體積和瘤重較對(duì)照組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;高劑量組消痰散結(jié)方可延長荷瘤鼠生存期，提高生存率。消痰散結(jié)方中、高劑量組中，Wnt/β-catenin通路蛋白β-catenin、TCF4和c-Myc表達(dá)下調(diào);多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Oct4和Nanog表達(dá)也不同程度下調(diào)，其他結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD44和CD133 mRNA表達(dá)水平也

19、下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1、無血清懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)的球體細(xì)胞富集了結(jié)腸癌干細(xì)胞。其體外增殖能力和體內(nèi)致瘤能力均強(qiáng)于親代細(xì)胞，球體細(xì)胞中部分結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物和Wnt/β-catenin通路相關(guān)因子的表達(dá)均顯著上調(diào)。
　　2、消痰散結(jié)方能夠在體外抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞移植瘤的生長，高劑量組消痰散結(jié)方可延長荷瘤鼠生存期，提高生存率;并能在體內(nèi)外下調(diào)部分結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物的表