光遺傳學技術在眨眼條件反射研究中的初探.pdf

1、條件反射行為的研究歷史長達一百年之久，其中眨眼條件反射行為是最簡單，也是應用最廣泛的聯(lián)合學習記憶模型之一。經典的眨眼條件反射（Eyeblink conditioning, EBC）通常分為delay及trace兩種模式，一般而言，以外周刺激（如視覺或聽覺刺激）作為條件刺激(Conditioned Stimulus, CS)來建立眨眼條件反射模型；同時，我們也發(fā)現一些以電刺激外周視聽信號上傳路徑所途經（中繼）的局部腦區(qū)（或核團）作為條件刺

2、激均成功建立了EBC的報告。已有研究提示前額葉在某些情況下參與了眨眼條件反射delay模式的建立或表達。這對傳統(tǒng)的結論----前額葉不參與 delay模式提出了挑戰(zhàn)，對此我們也非常感興趣，為什么在某些特殊情況下delay模式需要前額葉參與？因此，我們選擇了前額葉中分布最多的谷氨酸能神經元作為研究靶點來探索谷氨酸能神經元參與眨眼條件反射（delay模式）的神經機制。
　　光遺傳學技術是通過基因工程的方法將目標光通道敏感基因包裝到相關

3、病毒上，并將其轉染到動物的某一類神經元上，在完成一系列的分子生物學過程后光敏蛋白最終表達在特定細胞的細胞膜上，同時依據不同的光敏蛋白（如ChR2）的不同特性，實現對某一類型細胞或神經元精確至毫秒級的高分辨率調控的一門革命性技術。由于光遺傳學的獨特優(yōu)勢，光遺傳學為我們驗證 delay-EBC在某些情況下可能需要前額葉谷氨酸能神經元參與的推測提供了目前為止最優(yōu)的方法。通過 Pubmed的檢索，至今尚未發(fā)現以光刺激大腦內某一類神經元作為CS并

4、成功建立 EBC的報告。由此，我們采用光遺傳學技術特異操控內側前額葉（medial prefrontal cortex，mPFC）的谷氨酸能神經元，并以光激活這一群谷氨酸能神經元作為CS，從而探討此方式是否能成功建立delay-EBC及可能的內在神經機制。
　　材料和方法：通過立體定向注射手段，把攜帶有細胞特異性啟動子的視蛋白腺相關病毒 AAV2/8-CaMKIIα-ChR2-mCherry注射到mPFC。病毒注射3~4周后，一方

5、面通過熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡來判斷神經元膜表面是否表達有紅色熒光蛋白,以及其表達位置是否在mPFC，從而判斷光敏基因在谷氨酸能神經元表達的特異性。并利用在體細胞外記錄技術觀察表達AAV2/8-CaMKIIα-ChR2-mCherry的谷氨酸能神經元對不同光刺激頻率的反應特性，用以了解ChR2的通道生理功能，為行為學研究奠定基礎。另一方面經操控已經表達在自由活動動物 mPFC谷氨酸能神經元上的 ChR2通道完成行為學實驗：待病毒AA

6、V2/8-CaMKIIα-ChR2-mCherry靶向注射到大鼠右側mPFC4周后通過手術建立光神經界面，并預留打藥孔，分別用藍光（470 nm,10 mW/mm2,30 ms波寬，20 Hz）激活mPFC谷氨酸能神經元作為CS，電刺激眼輪匝肌作為US，觀察是否能建立delay-EBC；待條件行為建立完成后以微注射技術向 mPFC光照射部位注射短時失活藥物muscimol（GABA-A受體激動劑，氯離子通道開放導致氯離子大量進入細胞而達

7、到失活細胞的目的），觀察對delay-DEC的影響。
　　結果：（1）病毒成功注射到mPFC，94.6±0.9％的CaMKIIα表達的谷氨酸能神經元表達ChR2-mCherry蛋白，并且表達ChR2-mCherry蛋白的細胞98.87±0.3%是谷氨酸能神經元，提示在 CamKⅡα啟動子控制下，腺相關病毒載體可將光敏基因特異性的表達于谷氨酸能神經元（2）表達有ChR2-mCherry蛋白的谷氨酸能神經元對藍光（470 nm,20

8、mW/mm2,5 ms波寬，5~80 Hz）產生穩(wěn)定的反應，對低頻光刺激（5、10和20Hz）的反應性優(yōu)于高頻光刺激（40和80Hz）。（3）以藍光（470 nm,10 mW/mm2,30 ms波寬，20 Hz）激活mpfc谷氨酸能神經元為CS的條件下，大鼠能成功建立眨眼條件反射行為，通過靶向微注射muscimol能明顯影響delay-EBC的條件反應（conditioned response，CR）的表達。
　　結論：通過一系列