細胞核環(huán)境對染色質高級構象的影響.pdf

1、細胞核是真核生物特有的細胞器，它主要由細胞核被膜、核纖層、細胞核基質、染色質及核仁五部分組成。其亞細胞器相互獨立又相互關聯(lián)，共同組成一個精密有序的有機整體。細胞核是遺傳信息存儲和復制的重要場所，作為調控細胞代謝、分化及遺傳的核心中樞，在生命進程中發(fā)揮重要的功能。
　　染色質是真核細胞核中遺傳物質的存在形式。由 DNA、組蛋白、非組蛋白及部分RNA等組成，是真核生物體內最大的單一生物大分子。
　　2m左右長的DNA被壓縮組裝到

2、直徑6微米的細胞核中，顯示染色質經歷了高度有序的折疊壓縮。研究表明染色質是層次性有序折疊的。首先DNA纏繞在組蛋白八聚體核心中，形成核小體結構；其次以4個核小體為結構單元相互垛疊成左手螺旋的30nm結構；最后進一步地壓縮形成致密的染色質結構。根據致密程度的差異，染色質可分為常染色質和異染色質。
　　染色體構象捕獲技術3C（Chromosome Conformation Capture）的出現及其衍生技術4C、5C、Hi-C等的迅速

3、發(fā)展，為染色質三維高級結構的研究帶來了全新的機遇，開創(chuàng)了三維基因組這一全新的領域。高等動物基因組三維高級結構的5C和 Hi-C研究發(fā)現：染色質高級結構呈現分維構象，具有拓撲學相關結構域TAD（Topological Associated Domain），TAD是染色質高級構象結構和功能的基本單元。
　　染色質高級結構是分層級折疊的。在有絲分裂間期，不同染色體占據不同的相對獨立但有又穩(wěn)定的空間位置，形成染色質領域CT（Chromos

4、ome Territory），染色領域根據折疊程度的不同可以分為開放區(qū)域和密閉區(qū)域，這些區(qū)域則是由多個TADs相互聚集組成，TADs則可進一步分為拓撲學亞結構域Sub-TADs。分等級的染色質三維高級結構在細胞命運的穩(wěn)定維持中發(fā)揮重要作用。
　　研究表明染色質總體高級結構特別是TADs在不同細胞維持穩(wěn)定，物種之間相對保守，在單倍體精子細胞和二倍體成纖維細胞中，TAD仍然具有較高的一致性。但最近也有報道指出，染色質高級構象是可塑的，

5、在環(huán)境的刺激下，TADs會作出應答并發(fā)生重構，提示作為染色質折疊的結構和功能單元，TADs具有折疊魯棒性、穩(wěn)定性和一定的彈性。
　　普遍認為真核生物中已知唯一的絕緣子蛋白CTCF是染色質構象的關鍵組織者，其在介導染色質遠距離的相互作用、幫助建立和維持染色質三維高級結構等方面發(fā)揮重要的功能。但是染色質構象形成的具體分子機制等仍不是很清楚。染色質的折疊是否遵循自組織的原則根據其自身性質特別是DNA序列實現自我重構？不同細胞核環(huán)境對染色

6、質折疊得影響如何？在新的核環(huán)境下染色質折疊能否自洽完成等問題目前都尚不得而知。
　　針對上述問題，本研究選用帶有人21號染色體的動物模型TC1小鼠為研究材料，通過分析21號染色體在人細胞和鼠細胞染色質構象的異同，進而揭示細胞核環(huán)境對染色質高級構象的可能影響。
　　為了以較少的測序量獲得高精度的21號染色體構象數據，本研究基于液相雜交捕獲技術，建立了單染色體靶向富集的Capture Hi-C（cHiC）技術，利用生物信息學分析

7、工具及算法，從全局互作、TAD比較、遠距離互作、斷裂位點、重排片段等五個層次進行了研究分析。
　　第一部分，為富集21號染色體特異性片段，減少測序量，我們建立了單染色特異性捕獲方法。主要包括：正常核型的人胚肝細胞同步化到中期，低滲制備染色體懸液；利用流式細胞儀進行21號單染色體分選；采用MALBAC技術將21號染色體進行全染色體擴增；使用標準的建庫流程制備可用以轉錄的DNA文庫；采用T7 RNA轉錄酶進行RNA探針的制備；優(yōu)化液相

8、雜交體系，進行片段和文庫的雜交捕獲；用qPCR技術驗證靶向片段和文庫在捕獲后的富集效率。結果表明單片段可以得到數百倍的富集，而文庫的富集效率約為60倍。
　　第二部分，Capture Hi-C實驗的具體流程及文庫的質量控制。首先處死TC1小鼠，解剖獲取新鮮組織，制備單細胞懸液；Hi-C實驗制備雜交捕獲模板，并利用NheI限制性內切酶進行Hi-C實驗有效性等質控檢測，結果表明Hi-C文庫中嵌合片段的比例在70％以上，提示文庫制備正常

9、；利用制備的RNA探針進行雜交捕獲；qPCR結果表明21號染色體上特定片段的捕獲倍數達到約350倍。
　　第三部分，Capture Hi-C捕獲片段的高通量序列測定、數據質控和生物信息學分析。捕獲片段經過文庫制備、PCR擴增等后，在Illumina平臺使用125bp讀長的Hiseq2500進行高通量序列測定，獲得170M原始測序數據，數據過濾、比對分析后發(fā)現：Hi-C文庫的嵌合片段占總的配對末端Reads數85%，表明Hi-C建庫

10、質量良好；而來自人21號染色體有效數據占總的Di-tags數據的10%，證實文庫富集了近13.3倍；最后使用人21號染色體相互作用數據建模，獲得了人21號染色體的互作圖譜；由于在TC1小鼠中人21號染色體發(fā)生了重排，我們按照重排片段（包含重復和倒置）對TC1小鼠和人IMR90細胞中相應片段進行比較，發(fā)現重組片段內TAD得到了維持；斷裂位點處染色體互作強度和兩側的互作頻率的分析發(fā)現：在IMR90細胞和TC1重排的21號染色體中，而斷裂位點

11、一側到另一側的互作均要低于隨機選取的對照位點，這表明染色體重排后，重排片段仍然傾向于片段內部相互作用。Hi-C數據中1%最強的互作分析發(fā)現，正常細胞中這些互作主要集中在1Mb的線性范圍內，而TC1重排的人21號染色體中遠距離強相互作用所占比例顯著增強。
　　綜上，圍繞染色質的高級折疊是否遵循自組裝的原則、細胞核環(huán)境是否影響染色質高級構象這一科學問題，我們利用含有人類21號染色體的TC1小鼠這一獨特模型，通過單條染色體的流式分選、特

12、異性的擴增、RNA捕獲探針的制備、液相Capture Hi-C捕獲以及捕獲片段的高通量序列測定、互作片段的生物信息學分析等手段的綜合應用。結果發(fā)現：人的21號染色體在小鼠細胞核環(huán)境下，其染色質折疊的基本單元TAD得到維持，而且重組斷裂位點處一側到另一側互作弱于隨機對照，提示重排重組片斷更傾向于重組片斷內部之間互作，初步表明染色質的折疊具有一定的自洽性；斷裂位點區(qū)域互作強度低，暗示TAD可能作為染色質重排和演化的基本單元；此外，我們還發(fā)現