胞外蛋白酶抑制劑基因expi對(duì)大鼠肝再生的作用研究.pdf

1、胞外蛋白酶抑制劑基因expi編碼的蛋白與蛋白酶活性的有關(guān)，并參與細(xì)胞的遷移和凋亡活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)室的大鼠再生肝RatGenome230.20芯片檢測(cè)結(jié)果表明，expi在大鼠2/3肝切除后6h起始表達(dá)，6-72h持續(xù)表達(dá)上調(diào)，并在30h達(dá)到表達(dá)高峰，是對(duì)照的33倍。但目前還沒(méi)有人研究其在肝在生中的功能，而作為重要生命活動(dòng)的肝再生也涉及蛋白質(zhì)降解，細(xì)胞遷移和凋亡等生理生化活動(dòng)，了解該基因在肝再生中的功能，有助于揭示肝再生分子機(jī)制。為此，本文挑選

2、出基因expi，以Higgins等那建立的大鼠2/3肝切除模型做為研究對(duì)象，利用大鼠尾靜脈液壓轉(zhuǎn)基因技術(shù)，通過(guò)基因添加和RNA干涉的方法，研究expi在大鼠肝再生中的作用。
　　 根據(jù)expi的基因序列設(shè)計(jì)引物并克隆該基因，同時(shí)設(shè)計(jì)其兩條RNA干涉片段，然后進(jìn)行載體的構(gòu)建。將上述測(cè)序正確的基因及其干涉片段連接到不同的載體上，構(gòu)建三套載體：一套是表達(dá)載體pEGFP-N1-expi，用于基因添加實(shí)驗(yàn)；另一套是干涉載體，包括pGene

3、si1-1.0-E6和pGenesi1-1.0-E147,用于干涉目的的基因的實(shí)驗(yàn)；最后一套是檢驗(yàn)載體，包括pGenesi1-1.0-E6-expi,pGenesi1-1.0-E147-expi和pGenesi1-1.0-HK-expi,用于檢驗(yàn)設(shè)計(jì)的兩條干涉片段是否對(duì)靶基因產(chǎn)生干涉作用。
　　 將構(gòu)建的三條檢驗(yàn)載體分別進(jìn)行尾靜脈液壓轉(zhuǎn)基因操作，通過(guò)觀(guān)察轉(zhuǎn)干涉檢驗(yàn)載體和綠恍熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞率（轉(zhuǎn)染率）相較對(duì)照檢驗(yàn)載體是否有明顯減

4、少，來(lái)判斷設(shè)計(jì)的干涉片段是否對(duì)靶位點(diǎn)具有干涉作用。將表達(dá)載體和干涉載體分別進(jìn)行液壓轉(zhuǎn)基因操作，分別在轉(zhuǎn)基因后6、12、24、36、48、60、72和84h取材觀(guān)察其綠色熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞率、通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析得出各載體在大鼠肝臟組織中表達(dá)高峰的時(shí)間點(diǎn)，結(jié)合expi芯片檢測(cè)結(jié)果，得出2/3肝切除后的最佳轉(zhuǎn)基因時(shí)間。根據(jù)以上結(jié)果，利用2/3肝切除手術(shù)制備的大鼠肝再生模型和液壓轉(zhuǎn)基因技術(shù)展開(kāi)expi對(duì)大鼠肝再生過(guò)程影響的研究。將制備好的轉(zhuǎn)基因后的再生

5、肝材料分別于2/3肝切除后72、120和168h取出，用熒光顯微技術(shù)、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的常規(guī)組織學(xué)技術(shù)對(duì)死亡率、表達(dá)動(dòng)力學(xué)、肝指數(shù)和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面結(jié)果進(jìn)行觀(guān)察與分析。
　　 測(cè)序和電泳檢測(cè)結(jié)果顯示：基因expi克隆成功，其表達(dá)載體、干涉載體和檢驗(yàn)載體構(gòu)建成功。熒光觀(guān)察結(jié)果表明，轉(zhuǎn)檢驗(yàn)載體pGenesil-1.0-E6-expi和pGenesi1-1.0-E147-expi的綠色熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞率明顯低于其對(duì)照載體pGenesi1-

6、1.0-HK-expi，這說(shuō)明設(shè)計(jì)的兩干涉片段對(duì)靶位點(diǎn)均具有干涉作用。轉(zhuǎn)表達(dá)載體pEGFP-N1-expi和干涉載體pGenesi1-1.0-E6與pGenesi1-1.0-E147后，統(tǒng)計(jì)分析陽(yáng)性細(xì)胞率得出各載體在大鼠肝臟組織中表達(dá)高峰的時(shí)間點(diǎn)是轉(zhuǎn)基因后12h，結(jié)合expi芯片檢測(cè)結(jié)果，得出最佳轉(zhuǎn)基因時(shí)間點(diǎn)是2/3肝切除后18h。
　　 肝指數(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，在進(jìn)行expi基因添加時(shí)，肝指數(shù)高于對(duì)照；進(jìn)行expi基因干涉時(shí)，肝指