己酮可可堿預處理對癲癇大鼠中腦DA能神經元功能的改善及Nrf2-ARE通路的參與.pdf

1、癲癇(Epilepsy, EP)是一常見的慢性神經系統(tǒng)疾病，癲癇發(fā)作時大腦神經元興奮性增高及異常同步化放電，可導致短暫的中樞神經系統(tǒng)功能失調，臨床主要表現為突然出現和反復發(fā)作的驚厥行為。癲癇持續(xù)發(fā)作超過30分鐘則將引起腦內神經元的損傷或喪失，發(fā)展為癲癇持續(xù)狀態(tài)（Status epilepticus, SE）。癲癇患者或動物模型常伴有認知功能障礙，主要表現為學習記憶能力等的下降。研究發(fā)現認知行為與黑質-紋狀體和中腦邊緣多巴胺能神經體系密切

2、相關。而除了被廣泛熟知的谷氨酸和γ氨基丁酸，多巴胺（ dopamine, DA）也參與了癲癇的發(fā)作和傳播，如SE大鼠海馬（Hippocampus, Hip）和紋狀體DA含量減少，癲癇發(fā)作時黑質（Substantia nigra, SN）和紋狀體多巴胺轉運體（dopamine transporter, DAT）蛋白表達下降等。因此，推測保護DA能神經體系能夠改善癲癇發(fā)作引起的認知功能障礙。
　　癲癇的發(fā)病機制十分復雜，有研究證實氧化

3、應激產生的氧自由基連鎖反應是癲癇發(fā)作和神經退行性變的核心環(huán)節(jié)。氧化應激是由于體內氧化和抗氧化作用之間的穩(wěn)態(tài)失衡，導致自由基產生過多和（或）清除能力下降。在中樞神經系統(tǒng)中，自由基主要源于興奮性氨基酸和神經遞質的代謝。癲癇發(fā)作時神經元的異常放電和興奮性毒性作用使腦內活性氧自由基（Reactive oxygen species, ROS）產生增多，抗氧化能力減弱，過度堆積的ROS可極大的損傷神經元的結構和功能。同時，氧化應激也是DA能神經元退

4、行性變的機制之一，通過激活SN和腹側被蓋區(qū)（ventral tegmental, VTA）的抗氧化體系可改善衰老相關的DA能神經元的功能下降。因此，針對氧化應激在癲癇發(fā)作中的參與，提高抗氧化能力可能成為治療癲癇發(fā)作引起的DA能神經體系功能紊亂的一種手段。
　　NF-E2相關因子2(NF-E2-related factor2, Nrf2)是細胞調節(jié)氧化應激反應中的關鍵因子，近年研究發(fā)現Nrf2以Nrf2-ARE信號通路介導并激活多種

5、Ⅱ相解毒酶和抗氧化基因的轉錄，從而減輕氧化應激引起的細胞損傷，維持氧化-抗氧化系統(tǒng)在機體內的穩(wěn)態(tài)。生理條件下， Nrf2位于細胞質中與Keap1結合形成無活性的復合體。氧化應激狀態(tài)可誘導Nrf2與Keap1解離而活化，活化的Nrf2由細胞質轉移到細胞核，與抗氧化反應元件（The antioxidant response element, ARE）結合，啟動ARE下游的血紅素氧合酶1(Heme oxygenase1, HO-1)和依賴還原

6、型輔酶/Ⅱ醌氧化還原酶1(NADPH:quinone oxidoreductase1, NQO1)等抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶基因的轉錄和表達以增強細胞的抗氧化能力和保護細胞免受毒物損傷。研究已證實激活Nrf2-ARE信號通路可增加總蛋白和細胞核Nrf2的表達，該信號通路的中斷增加了機體對氧化應激和有毒物質的易感性，而上調神經元HO-1或NQO1的表達可保護它們抵抗氧化應激和興奮性毒性作用的損傷。近期研究表明萊菔硫烷（Sulforaphan

7、e, SF）可通過激活Nrf2-ARE信號通路改善慢性杏仁核點燃動物模型癲癇發(fā)作引起的氧化應激狀態(tài)和認知障礙。
　　己酮可可堿（Pentoxifylline, PTX）是一種非特異性磷酸酶二酯酶抑制劑（Phosphodiesterase inhibitors, PDEI）和弱腺苷受體拮抗劑，可以快速有效的穿過血-腦屏障（Blood-brain barrier, BBB）發(fā)揮抗氧化作用和調控腦內的各種神經遞質釋放。由于PTX的血液流

8、變學作用，最初常用于治療呼吸系統(tǒng)和外周血管系統(tǒng)疾病。近年有研究發(fā)現PTX具有神經保護作用，可以改善中風、腦缺血等引起的神經行為學障礙，提高谷氨酸致海馬損傷大鼠的學習記憶能力，預先腹腔給予PTX可減輕SE大鼠的發(fā)作程度和海馬的神經損傷，但其機制尚不清楚。
　　癲癇發(fā)作起病突然，需要快速終止癇性發(fā)作尤其是SE以防止腦內相關神經元的損傷。口服、肌肉注射、靜脈點滴等常規(guī)給藥方式導致藥物不能被快速吸收或操作無法立即實施，可能延遲或失去治療的

9、最佳時機，危及到病人的生命。之前的研究顯示通過鼻腔給予中重度青少年和成年癲癇患者咪達唑侖、地西泮和勞拉西泮可以有效終止癲癇發(fā)作并避免發(fā)作后的行為學改變，是一種安全易行的治療手段。目前，鼻腔給予PTX對癲癇發(fā)作是否有效尚無研究。
　　氯化鋰-匹羅卡品（lithium-pilocarpine, Li-Pc）誘發(fā)的大鼠癲癇模型具有與人類顳葉癲癇相似的病理和臨床特征，是理想的顳葉癲癇動物模型，適用于篩選抗癲癇藥物及探討癲癇形成機理。因此，

10、本課題以Li-Pc誘發(fā)的癲癇發(fā)作大鼠為動物模型，觀察鼻腔給予PTX對大鼠癲癇發(fā)作和認知行為的影響；檢測并分析與認知行為密切相關的中腦腹側DA能神經元的功能；分析并探討氧化應激各指標及Nrf2、HO-1和NQO1在觀察腦區(qū)的表達改變；檢測相關腦區(qū)cAMP的含量變化。期望所獲結果為癲癇的發(fā)病機制和治療提供實驗依據，同時為PTX治療癲癇提供新的給藥途徑。
　　第一部分 PTX降低Li-Pc誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作并改善其認知功能障礙
　　

11、目的：探討PTX預處理對Li-Pc誘發(fā)的大鼠癲癇發(fā)作和認知行為障礙的影響。
　　方法：以Li-Pc誘發(fā)的癲癇發(fā)作大鼠動物模型，鼻腔或腹腔預先給予大鼠PTX；計數癲癇發(fā)作率、癲癇發(fā)作潛伏期等指標；Morris水迷宮實驗檢測大鼠的認知行為；Timm染色顯示大鼠海馬CA3區(qū)苔蘚纖維出芽（Mossy fiber sprouting, MFS）；液質聯(lián)用（HPLC-MS）檢測大鼠海馬DA及其代謝產物含量。
　　結果：
　　1一般

12、觀察：空白對照組和各藥物對照組大鼠無異常反應。SE-in組和SE-ip組大鼠在匹羅卡品注射6min或5min后逐漸表現為縮瞳、輕微顫抖、豎毛、流涎、血淚、腹瀉和刻板運動等外周膽堿能癥狀。癲癇發(fā)作率為100％；癲癇發(fā)作潛伏期分別為11.92±3.38 min和10.77±3.52 min；85.71%（SE-in組）和80.95%（SE-ip組）的大鼠發(fā)展為癲癇持續(xù)狀態(tài)，癲癇持續(xù)狀態(tài)潛伏期分為24.07±2.17 min和25.19±4.

13、41 min。匹羅卡品注射后24h內死亡率為9.52%。
　　己酮可可堿預處理減少癲癇發(fā)作率、減輕癲癇發(fā)作的外周膽堿能癥狀，縮短癲癇發(fā)作時間。與相應的癲癇發(fā)作組（ SE-in、SE-ip）相比， PTX+SE-in組（23.81%）和PTX+SE-ip組（38.10%）癲癇發(fā)作率明顯降低(P<0.01)；PTX+SE-in組（33.59±6.15）和PTX+SE-ip組（28.33±5.50）平均潛伏期明顯延長(P<0.01)。P

14、TX+SE-in組和PTX+SE-ip組均未出現癲癇持續(xù)狀態(tài)(P<0.01)，大鼠在匹羅卡品注射后24h內存活率100%。
　　2 Morris水迷宮
　　鼻腔給藥組：
　　Morris水迷宮的1-5天各組大鼠尋找平臺的逃避潛伏期存在顯著統(tǒng)計學差異（P<0.01），各組實驗大鼠找到平臺的逃避潛伏期逐日遞減；與Con-in組相比，SE-in組大鼠找到平臺的逃避潛伏期顯著延長（P<0.01）；與SE-in組相比， PTX+

15、SE-in組大鼠找到平臺的逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05），接近正常水平；Con-in組、LiCl-in組和PTX-in組大鼠逃避潛伏期無明顯差異。SE-in組大鼠穿越平臺的次數以及在目標象限停留的時間均顯著低于Con-in組（P<0.01）；與SE-in組相比，PTX+SE-in組大鼠穿越平臺象限的次數以及在目標象限停留的時間均顯著增加（P<0.01）；Con-in組、LiCl-in組和PTX-in組大鼠在空間探索實驗中無明顯差異。

16、
　　腹腔給藥組：與SE-ip組相比，腹腔注射PTX顯著縮短了大鼠的逃避潛伏期顯著延長（P<0.01）；增加了其穿越平臺的次數以和在目標象限游泳的時間（P<0.01）。
　　3 Timm染色
　　鼻腔給藥組：Con-in組、LiCl-in組、PTX-in組、SE-in組和PTX+SE-in組五組間CA3區(qū)的Timm染色評分（Kruskal–Wallistest,χ2=15.579, P<0.01）存在顯著差異。各組間比

17、較表明 SE-in組大鼠 Timm染色評分較 Con-in組顯著升高（P<0.01）。PTX+SE-in組大鼠Timm染色評分較SE-in組明顯降低（P<0.01）。各對照組間Timm染色評分無明顯區(qū)別。
　　腹腔給藥組：與SE-ip組相比，腹腔注射PTX也顯著改善Li-Pc誘發(fā)大鼠在海馬CA3區(qū)的的Timm染色評分（P<0.01）。
　　4 DA及其代謝產物
　　鼻腔給藥組：Con-in組、LiCl-in組、PTX-

18、in組、SE-in組和PTX+SE-in組五組間 Hip的 DA(F(4,22)=61.733, P<0.01)、DAPAC(DOPAC:F(4,22)=92.890, P<0.01)和HVA(HVA:F(4,22)=40.507, P<0.01)含量明顯不同。各組間兩兩比較發(fā)現，與Con-in組比較，SE-in組DA及其代謝產物的含量明顯下降(P<0.01)；與SE-in組相比，PTX+SE-in組大鼠DA、DOPAC和 HVA在Hi

19、p處分別升高了93%、216%和51%(P<0.01)。各對照組之間DA、DAPAC和HVA含量無明顯區(qū)別。
　　腹腔給藥組：與SE-ip組相比，PTX+SE-ip組大鼠DA、DOPAC和HVA在Hip腦區(qū)分別升高了86%、160%和53%(P<0.01)。
　　小結：
　　1 Li-Pc誘發(fā)的癲癇發(fā)作大鼠伴有認知功能障礙。
　　2 PTX預處理降低Li-Pc誘發(fā)大鼠的癲癇發(fā)作并改善其認知功能障礙。
　　3

20、 PTX預處理減少Li-Pc誘發(fā)癲癇大鼠海馬苔蘚纖維的發(fā)芽、降低DA能神經支配的損傷。
　　4鼻腔給藥可作為治療癲癇的一種給藥途徑。
　　第二部分 PTX改善Li-Pc誘發(fā)癲癇大鼠中腦DA能神經元的功能活動
　　目的：探討PTX預處理對Li-Pc誘發(fā)癲癇大鼠中腦腹側（ Ventral midbrain, VM）、尾殼核(Caudate-putamen, CPu)和海馬(Hippcampus, Hip)多巴胺能神經活動的

21、影響。
　　方法：利用實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，RT-PCR）檢測大鼠VM的TH mRNA和DAT mRNA含量、免疫印跡技術分析大鼠VM、CPu和Hip TH和DAT的蛋白變化、液質聯(lián)用技術測定大鼠CPu DA及其代謝產物的含量。
　　結果：
　　1 RT-PCR
　　鼻腔給藥組：Con-in組、LiCl-in組、PTX-in組、SE-in組和PTX+SE-in組

22、五組間TH mRNA（one-way ANOVA, F(4,22)=72.686, P<0.01）和DAT mRNA（Kruskal–Wallistest,χ2=17.715, P<0.01）表達存在顯著差異。各組間比較表明SE-in組大鼠TH mRNA和DAT mRNA的RQ值較Con-in組分別降低了36.17%和36.89%（P<0.01）。PTX+SE-in組大鼠TH mRNA和DAT mRNA的RQ值較SE-in組分別升高了4

23、7.76%和49.51%（P<0.01），恢復到Con-in組水平。各對照組之間TH mRNA和DAT mRNA的RQ值無明顯區(qū)別。
　　腹腔給藥組：PTX+SE-ip組大鼠TH mRNA和DAT mRNA的RQ值較SE-ip組分別升高了42.40%和46.73%（P<0.01），恢復到Con-ip組水平。
　　2免疫印跡結果
　　鼻腔給藥組：Con-in組、LiCl-in組、PTX-in組、SE-in組和PTX+SE

24、-in組五組間VM(TH:F(4,22)=144.914, P<0.01;DAT:χ2=14.314, P<0.01)、CPu(TH: F(4,22)=50.721, P<0.01; DAT:χ2=16.280, P<0.01)和 Hip(TH:F(4,22)=18.219, P<0.01;3K, DAT:χ2=17.015, P<0.01) TH及DAT與內參的相對吸光度比值顯著不同。各組間比較表明，與Con-in組相比，SE-in組

25、大鼠TH和DAT與內參免疫印跡條帶的相對吸光度比值在VM、CPu和Hip明顯降低(P<0.01)；與SE-in組相比，PTX+SE-in組大鼠TH和DAT與內參免疫印跡條帶的相對吸光度比值在VM分別升高了282%和173%(P<0.01)，在CPu分別升高了190%和100%(P<0.01)，在Hip分別升高了63%和290%(P<0.01)，恢復至正常水平。
　　腹腔給藥組：與SE-ip組相比，PTX+SE-ip組大鼠TH和DA

26、T與內參免疫印跡條帶的相對吸光度比值在 VM分別升高了270%和182%(P<0.01)，在CPu腦區(qū)分別升高了144%和72%(P<0.01)，在Hip分別升高了40%和205%(P<0.01)，DAT在Hip處的表達仍低于Con-ip組水平（P<0.05）。
　　3 HPLC-MS
　　鼻腔給藥組：Con-in組、LiCl-in組、PTX-in組、SE-in組和PTX+SE-in組五組間在 CPu的 DA(F(4,22)

27、=49.223, P<0.01)、DAPAC(DOPAC:F(4,22)=29.512, P<0.01)和HVA(HVA:F(4,22)=33.023, P<0.01)含量明顯不同。各組間兩兩比較發(fā)現，與Con-in組比較，SE-in組DA及其代謝產物的含量明顯下降(P<0.01)；與 SE-in組相比，PTX+SE-in組大鼠 DA、DOPAC和 HVA在CPu處分別升高了74%、33%和68%(P<0.01)。
　　腹腔給藥組

28、：與SE-ip組相比，PTX+SE-ip組大鼠DA、DOPAC和HVA在CPu處分別升高了67%、43%和86%(P<0.01)。
　　小結：
　　1 Li-Pc誘發(fā)癲癇發(fā)作大鼠的中腦DA能神經活動減弱。
　　2 PTX預處理改善Li-Pc誘發(fā)癲癇發(fā)作大鼠中腦的DA能神經活動。
　　3鼻腔給予PTX對Li-Pc誘發(fā)癲癇發(fā)作大鼠中腦的DA能神經活動活動的改善作用優(yōu)于腹腔給藥途徑。
　　第三部分 PTX對Li-

29、Pc誘發(fā)癲癇大鼠腦內Nrf2-ARE通路的腦區(qū)特異性激活
　　目的：觀察PTX預處理對Li-Pc誘發(fā)癲癇大鼠腦內氧化應激參數、Nrf2-ARE通路和cAMP含量的影響，探討PTX對Li-Pc誘發(fā)癲癇大鼠中腦DA能神經元保護的可能機制。
　　方法：分光光度法檢測VM和Hip氧化應激參數（MDA、LPO、GSH和SOD）；RT-PCR測定VM和Hip的Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA和NQO1 mRNA的含量；免疫印跡分析

30、VM和Hip的Nrf2、HO-1和NQO1蛋白改變；放免法檢測VM和Hip腦組織中cAMP的水平。
　　結果：
　　1氧化應激參數
　　鼻腔給藥組：Con-in組、LiCl-in組、PTX-in組、SE-in組和PTX+SE-in組五組間MDA(VM:χ2=17.033, P<0.01; Hip: F(4,22)=35.598, P<0.01)、LPO(VM:χ2=16.419, P<0.01; Hip:χ2=16.6

31、93, P<0.01)、 GSH(VM:F(4,22)=66.059, P<0.01; Hip: F(4,22)=68.995, P<0.01)和 SOD(VM:F(4,22)=37.864, P<0.01; Hip: F(4,22)=12.912, P<0.01)在VM和Hip含量存在顯著不同。各組間比較表明，SE-in組大鼠MDA和LPO在VM和Hip含量比Con-in組顯著升高(P<0.01)，GSH和SOD在VM和Hip腦區(qū)含量

32、比Con-in組顯著降低(P<0.01)；與SE-in組相比，PTX+SE-in組大鼠MDA在VM和Hip腦區(qū)分別降低了14%和23%(P<0.01)，LPO在VM和Hip腦區(qū)分別降低了31%和30%(P<0.01)， GSH在VM和Hip腦區(qū)分別升高了78%和76%(P<0.01)，SOD在VM和Hip分別升高了25%和19%(P<0.01)。Con-in組、LiCl-in組和PTX-in組各氧化應激指標在觀察腦區(qū)無明顯區(qū)別。

33、　　腹腔給藥組：與SE-ip組相比，PTX+SE-ip組大鼠腦內MDA在VM和Hip腦區(qū)分別降低了19%和23%(P<0.01)，LPO在VM和Hip腦區(qū)分別降低了24%(P<0.01)和28%(P<0.01)，GSH在VM和Hip腦區(qū)分別升高了101%和86%(P<0.01)，SOD在VM和Hip腦區(qū)分別升高了21%和22%(P<0.01)。Con-ip組、LiCl-ip組和PTX-ip組各氧化應激指標在觀察腦區(qū)無明顯區(qū)別。
　

34、　2 RT-PCR
　　鼻腔給藥組：Con-in組、LiCl-in組、PTX-in組、SE-in組和PTX+SE-in組五組間Nrf-2 mRNA（VM:F(4,22)=21.305, P<0.01;Hip:F(4,22)=65.829, P<0.01）、HO-1 mRNA（VM:F(4,22)=21.598, P<0.01;Hip:F(4,22)=37.175, P<0.01）和NQO1 mRNA（VM:χ2=15.963, P

35、<0.01; Hip: F(4,22)=66.175, P<0.01）表達存在顯著差異。各組間比較表明，SE-in組大鼠Nrf2 mRNA, HO-1 mRNA and NQO1 mRNA在VM和Hip含量比Con-in組明顯降低(P<0.01)；與SE-in組相比，PTX+SE-in組大鼠Nrf2 mRNA, HO-1 mRNA and NQO1 mRNA在VM分別升高了60%、38%和90%(P<0.01)，在Hip較SE-in組無

36、明顯變化，仍然低于Con-in組（P<0.01）。
　　腹腔給藥組：與SE-ip組相比，PTX+SE-ip組大鼠Nrf2 mRNA, HO-1 mRNA and NQO1 mRNA在VM分別升高了50%、41%和82%(P<0.01)，在Hip較SE-ip組無明顯變化，仍然低于Con-ip組（P<0.01）。
　　3免疫印跡：
　　鼻腔給藥組：Con-in組、LiCl-in組、PTX-in組、SE-in組和PTX+SE

37、-in組五組間 Nrf-2（ VM: F(4,22)=84.169, P<0.01; Hip: F(4,22)=65.157, P<0.01）、HO-1（VM: F(4,22)=71.535, P<0.01; Hip: F(4,22)=82.190, P<0.01）和NQO1（VM:χ2=17.290, P<0.01;Hip:F(4,22)=67.932, P<0.01）表達存在顯著差異。各組間比較表明，與 Con-in組相比，SE-i

38、n組大鼠Nrf2, HO-1 and NQO1在VM和Hip腦區(qū)表達明顯降低(P<0.01)；與SE-in組相比，PTX+SE-in組大鼠Nrf2, HO-1 and NQO1在VM腦區(qū)分別升高了262%(P<0.01),121%(P<0.01)和65%(P<0.01)， PTX+SE-in組大鼠Nrf2, HO-1和 NQO1在Hip腦區(qū)較SE-in組無明顯變化，仍然低于Con-in組（P<0.01）。
　　腹腔給藥組：統(tǒng)計分析

39、發(fā)現，與SE-ip組相比，PTX+SE-ip組大鼠Nrf2 mRNA, HO-1 mRNA and NQO1 mRNA在VM腦區(qū)分別升高了252%(P<0.01),129%(P<0.01)和36%(P<0.01)，PTX+SE-ip組大鼠Nrf2, HO-1 and NQO1在Hip腦區(qū)較SE-ip組無明顯變化，仍然低于Con-ip組（P<0.01）。
　　4 cAMP
　　鼻腔給藥組：Con-in組、LiCl-in組、PT

40、X-in組、SE-in組和PTX+SE-in組五組間cAMP含量在VM（one-way ANOVA, F(4,22)=9.829, P<0.01）和Hip（Kruskal–Wallistest,χ2=15.319, P<0.01）存在顯著差異。各組間比較表明SE-in組大鼠cAMP含量在VM和Hip處較Con-in組分別降低了29.18%和23.90%（P<0.01）；PTX+SE-in組大鼠cAMP含量在VM和Hip處較SE-in組分

41、別升高了32.47%和26.11%（P<0.01），恢復到Con-in組水平。
　　腹腔給藥組：與Con-ip組相比， SE-ip組大鼠cAMP含量在VM和Hip處分別降低了30.23%和25.84%（P<0.01）；PTX+SE-ip組大鼠cAMP含量在VM和Hip處較SE-ip組分別升高了31.90%和25.93%（P<0.01），恢復到Con-ip組水平。
　　小結：
　　1 Li-Pc誘發(fā)癲癇發(fā)作大鼠的腦內氧化

42、損傷增加、抗氧化能力減弱。
　　2 PTX預處理特異性激活Li-Pc誘發(fā)癲癇發(fā)作大鼠中腦腹側Nrf2-ARE通路、改善癲癇大鼠腦內的氧化應激狀態(tài)。
　　3 PTX預處理提高Li-Pc誘發(fā)癲癇發(fā)作大鼠VM和Hip的cAMP水平。
　　4鼻腔給予PTX對氧化應激狀態(tài)的改善優(yōu)于腹腔給藥。
　　結論：
　　1 PTX預處理降低Li-Pc誘發(fā)大鼠的癲癇發(fā)作，改善其認知功能障礙及中腦DA能神經元的功能活動。