基于超高速離心濃縮技術的HBV低載量樣本檢測體系的初步研究.pdf

1、目的:
　　乙肝病毒是我國主要的輸血傳播病原體之一。雖然目前在全國統(tǒng)一開展了核酸檢測措施，但仍然存在一定的殘余風險。主要因為部分獻血者體內病毒載量極低，低于常用的多人份混樣檢測試劑的靈敏度，加之目前大部分進口試劑的設計不太適合國內的病毒流行株。針對目前出現(xiàn)的問題，本文主要目的是初步研究適合中國流行特征的HBV低載量樣本的篩查/定量檢測體系。
　　方法:
　　1、選定磁珠法提取體系的成分，通過正交設計表初步確定其濃度或酸

2、堿度，主要包括GuSCN、蛋白酶K、異丙醇及PH;固定其它因素，優(yōu)化單一成分濃度，最終確定提取體系各成分濃度;選擇4種廠家的硅基磁珠，比較不同磁珠的提取效果;確定磁珠種類后，優(yōu)化磁珠用量。確定提取體系后與成品化提取試劑盒(包括QIAamp(@) DNA Blood Mini Kit及MagPure Viral DNA/RNA Mini KF Kit)進行比較。
　　2、在NCBI的Nucleotide中輸入HBV、China、co

3、mplete genome等關鍵詞找到中國地區(qū)的HBV序列，經比對后在保守序列設計引物探針，引物擴增的PCR產物經PMD-19載體連接制備成質粒標準品并測序驗證序列，計算質?？截悢?，并稀釋成不同濃度的質粒標準品，購買第三方標準品對質粒標準品進行校正，繪制HBV標準曲線，并用Probit分析計算檢測下限，驗證靈敏度、特異性等。將建立好的HBV熒光定量檢測方法檢測100例樣本，并與羅氏cobas(@)TaqScreenMPX Test，ve

4、rsion2.0檢測試劑盒檢測結果進行相關性分析。
　　3、用HBV陰性血漿稀釋HBV標準品，制成低拷貝樣本;固定離心時間，研究不同離心力與病毒回收率的關系;固定離心力，研究離心時間對回收率的影響;最后使用低載量樣本對超高速濃縮技術進行驗證并評估其應用價值。
　　結果:
　　1、提取體系的優(yōu)化結果:GuSCN濃度2.0M，蛋白酶K濃度為0.89mg/ml，異丙醇35％，PH為8;磁珠的選擇:A磁珠;磁珠用量:30ul。

5、建立的磁珠提取系統(tǒng)在高、中、低三個濃度的提取效率與兩種試劑盒比較均有統(tǒng)計學差異。
　　2、建立的HBV檢測體系引物探針特異性好，質粒測序結果完全吻合，標準品曲線R2＞0.999，擴增效率為92.75％，線性范圍為5.0×101-2.5×109IU/mL，95％檢測下限為16.2IU/mL，批內重復變異系數為0.15％-1.11％，批間變異系數為0.91％-4.67％。與羅氏檢測結果相關關系為y=0.916x+2.186，(R=0.

6、96; P＜0.001)。
　　3、當離心力在15000g-90800g時，HBV病毒回收率從41.43％增加至88.29％;當離心力在為90800g-138900g時，HBV病毒回收率相對穩(wěn)定在80％-90％之間;當離心力在138900g-171000g時，HBV病毒回收率從88.29％下降至62.94％。離心時間為0.5h、1h、1.5h及2h時，其回收分別為88.31％、89.70％、88.40％、75.62％。運用濃縮技術

7、后，發(fā)現(xiàn)8例cobas(@)TaqScreen MPX Test，version2.0漏檢樣本。
　　4、將超高速離心濃縮技術與本實驗建立的HBV檢測體系結合時，單個樣本取樣量不少于2ml時（N人份混檢時，每個樣本取2ml混合，共N*2ml），離心濃縮后靈敏度可達2IU/mL;單個樣本取樣量不少于4ml時（N人份混檢時，每個樣本取4ml混合，共N*4ml），靈敏度可達1IU/mL。
　　結論:
　　1、通過優(yōu)化提取試劑