甲基化CpG結合蛋白2對骨肉瘤生物學特性的影響和機制研究.pdf

1、骨肉瘤是最為常見的骨原發(fā)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內呈現(xiàn)逐年升高的趨勢。骨肉瘤通常來源于原始的間充質來源的轉化細胞，如股骨遠端，脛骨近端和肱骨近端，一般好發(fā)于二十歲左右的青年。針對DNA甲基化的修飾，已成為腫瘤治療的一種新型靶點。DNA高甲基化在促使腫瘤抑制基因沉默的過程中起到了至關重要的作用，已成為人類癌癥的研究熱點，而這種現(xiàn)象與經(jīng)典的基因突變具有相似的意義。甲基化CpG結合蛋白(methyl-CpG binding pro

2、teins，MBDs)是招募染色體沉默相關復合物結合到甲基化DNA上的重要橋梁分子，是介導高甲基化DNA抑制基因轉錄的重要蛋白家族，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中異常高甲基化區(qū)域的出現(xiàn)使得MBD蛋白可能成為有意義的治療靶點。目前針對表觀遺傳修飾的藥物最大的缺點是會引起基因組低甲基化，導致整個基因組不穩(wěn)定，因此研究以MBD蛋白為靶點的針對表觀遺傳學的抗腫瘤治療比以DNA甲基轉移酶為靶點的抗腫瘤治療更具特異性，可減少副作用。在前期研究中，我們建立了成

3、骨細胞惡性轉化的模型，并利用基因芯片發(fā)現(xiàn)印跡基因TSSC3參與了成骨細胞的惡性轉化，TSSC3啟動子區(qū)呈高甲基化，TSSC3的表達沉默在骨肉瘤細胞獲得失巢凋亡抵抗中起著至關重要的作用。TSSC3作為一種潛在的抑癌基因，可能成為骨肉瘤治療的一個新靶標。我們設想，MBD蛋白可能在介導骨肉瘤TSSC3基因表達沉默中起作用。通常情況下，MBD蛋白，如甲基化CpG結合蛋白2(MeCP2)，甲基化CpG結合域1(MBD1)以及MBD2，能夠特異性的

4、結合甲基化的CpG，同時與組蛋白去乙?；?HDAC)相關。甲基化CpG結合蛋白2(Methyl-CpG-binding protein2，MeCP2)是MBDs蛋白家族中被研究最為廣泛的蛋白。MeCP2是人腦發(fā)育的必需蛋白，而且，MeCP2與許多的癌癥和神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病密切相關。本研究采用染色質免疫沉淀法，首先通過四對引物檢測MeCP2蛋白結合TSSC3基因的活性;然后選擇兩個特異性siRNA，在LV-MeCP2-RNAi處理過的細

5、胞中觀察MeCP2基因表達;CCK8檢測空白LV-MeCP2-RNAi-CN與轉染LV-MeCP2-RNAi的SaOS2和U2OS細胞增殖水平的差異;通過劃痕實驗和Matrigel侵襲實驗檢測LV-MeCP2-RNAi對于U2OS和SaOS2細胞遷移侵襲能力的影響;應用流式細胞分析U2OS和SaOS2細胞的凋亡情況;細胞克隆形成實驗檢測LV-MeCP2-RNAi對于U2OS和SaOS2細胞的抑制情況;通過建立U2OS和SaOS2裸鼠皮下

6、移植瘤模型，分為轉染LV-MeCP2-RNAi組和未轉染LV-MeCP2-RNAi組，之后測量移植瘤的體積;最后通過基因芯片篩選出與MeCP2相關的具有生物學意義的差異表達基因;通過硫化測序PCR法(Bisulfite Sequencing PCR，BSP)檢測IGFBP4基因啟動子區(qū)的CpG甲基化水平。目的在于探索MeCP2在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制，并以此為基礎發(fā)現(xiàn)骨肉瘤的新的治療靶點。
　　主要結果如下:
　　1

7、.染色質免疫沉淀法檢測MeCP2蛋白結合TSSC3基因的活性，結果顯示MeCP2在U2OS和SaOS2細胞中表達顯著升高，表明MeCP2與TSSC3基因擁有最強的結合力。
　　2.選擇兩個特異性siRNA，在LV-MeCP2-RNAi處理過的細胞中觀察MeCP2基因表達，與對照細胞相比，LV-MeCP2-RNAi能降低MeCP2基因在U2OS和SaOS2細胞中的表達，但同時也降低了TSSC3的表達，差異有統(tǒng)計學意義。
　　3

8、.CCK8實驗顯示LV-MeCP2-RNAi可抑制SaOS2和U2OS細胞增殖力，差異有統(tǒng)計學意義。
　　4.劃痕實驗和Matrigel侵襲實驗檢測LV-MeCP2-RNAi對于U2OS和SaOS2細胞侵襲能力的影響，結果顯示，與空白LV-MeCP2-RNAi-CN轉染組相比，轉染LV-MeCP2-RNAi組U2OS和SaOS2細胞侵襲和遷移能力受到明顯抑制，差異有統(tǒng)計學意義。
　　5.應用流式細胞技術分析了U2OS和SaO

9、S2細胞的凋亡情況，結果顯示與空白LV-MeCP2-RNAi-CN轉染組相比，轉染LV-MeCP2-RNAi組U2OS和SaOS2細胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學意義。
　　6.細胞克隆形成實驗顯示LV-MECP2-RNAi可抑制SaOS2和U2OS細胞克隆形成。結果提示LV-MeCP2-RNAi抑制U2OS和SaOS2的體外成瘤能力，差異有統(tǒng)計學意義。
　　7.裸鼠皮下成瘤實驗顯示LV-MeCP2-RNAi可抑制SaOS2和U

10、2OS細胞的體內成瘤能力，差異有統(tǒng)計學意義。
　　8.通過基因芯片從49395個轉錄子中篩選出107個差異表達基因，34基因表達上調，73個基因表達下調。其中5個基因與骨肉瘤細胞增殖的功能改變密切相關，它們包括IGFBP4，HOXC8，LMO4，MDK和CTGF。
　　9.通過硫化測序PCR法(Bisulfite Sequencing PCR， BSP)檢測IGFBP4基因的CpG甲基化，結果顯示IGFBP4基因序列P1區(qū)C

11、pG島顯著的高甲基化。
　　10.LV-MeCP2-RNAi能降低MeCP2基因在U2OS和SaOS2細胞中的表達，同時增高了IGFBP4的表達，差異有統(tǒng)計學意義。
　　主要結論如下:
　　1.在骨肉瘤U2OS和SaOS2細胞中，三種甲基化CpG結合蛋白中MeCP2與TSSC3基因擁有最強的結合力，但這種作用并不是調節(jié)TSSC3表達的主要機制，具體機制還有待進一步研究。
　　2.MeCP2的基因沉默可以阻斷MeC

12、P2的表達，抑制骨肉瘤U2OS和SaOS2細胞的增殖、侵襲和轉移及成瘤能力，并誘導腫瘤細胞的凋亡。
　　3.MeCP2基因參與骨肉瘤細胞的增殖調控過程。其中IGFBP4、HOXC8、LMO4、MDK和CTGF基因可能參與了MeCP2介導骨肉瘤細胞增殖的過程。
　　4.骨肉瘤SaOS2細胞中IGFBP4基因可能是MeCP2的靶向分子，可以通過RNAi阻斷降低MeCP2的表達水平，恢復IGFBP4的部分表達及抑制腫瘤的功能，從而