E-cadherin通過Notch信號通路介導(dǎo)前列腺癌耐藥的分子機制.pdf

1、本文內(nèi)容分為三部分進行論述：
　　第一部分:紫杉醇誘導(dǎo)的前列腺癌耐藥細胞株EMT特征分析
　　目的:
　　通過與親本前列腺腫瘤細胞PC3，DU145相比較，證實其耐藥細胞株P(guān)C3-TxR，DU145-TxR中是否有EMT發(fā)生。
　　方法:
　　1.倒置顯微鏡下觀查對數(shù)生長期的親本腫瘤細胞PC3，DU145及其耐藥細胞PC3-TxR，DU145-TxR之間的形態(tài)差異，并拍照;
　　2.應(yīng)用RT-PCR，

2、Real-time PCR, Western-blot等方法檢測已知的EMT相關(guān)標記物E-cadherin，N-cadherin，Vimentin等在親本腫瘤細胞PC3，DU145及其耐藥細胞PC3-TxR，DU145-TxR之間的表達差異;
　　3.采用劃痕實驗實驗，Transwell小室實驗檢測親本細胞PC3，DU145及其耐藥細胞PC3-TxR，DU145-TxR之間遷移和侵襲能力差異;
　　4.通過采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)

3、，構(gòu)建熒光素酶轉(zhuǎn)染的親本PC3，DU145細胞及其耐藥細胞PC3-TxR，DU145-TxR，構(gòu)建成功以后，皮下注射到6周齡雄性SCID小鼠體內(nèi)，隨時觀測成瘤情況，小動物活體成像系統(tǒng)檢測小鼠體內(nèi)成瘤能力差異;
　　結(jié)果:
　　1.和親本PC3，DU145細胞相比較，耐藥細胞PC3-TxR，DU145-TxR形態(tài)狹長、呈梭形，細胞之間更為疏散，呈間充質(zhì)樣形態(tài)改變;
　　2.與親本PC3，DU145細胞相比較，耐藥細胞PC

4、3-TxR，DU145-TxR中E-cadherin表達明顯下調(diào)，同時Vimentin，Snail，N-cadherin表達上調(diào);
　　3.DU145細胞24小時的細胞遷移率為15.9±3.20％，DU145-TxR細胞24小時的細胞遷移率為68.6±2.85％，DU145-TxR細胞的遷移能力強于其親本細胞DU145(P＜0.01)。Transwell實驗顯示PC3-TxR細胞24小時的侵襲和遷移能力明顯強于親本PC3細胞(P＜

5、0.01);同樣DU145-TxR細胞24小時的侵襲和遷移能力也強于親本DU145細胞(P＜0.01);
　　4.成功構(gòu)建熒光素酶轉(zhuǎn)染的四種細胞株:PC3-luc，PC3-TxR-luc，DU145-luc，DU145-TxR-luc，熒光酶活性指數(shù)分別為:3.70×107，9.30×107，2.90×107，4.22×107;PC3-TxR-luc細胞腫瘤體積明顯大于PC3-luc細胞(P＜0.01);
　　結(jié)論:

6、　　與親本前列腺腫瘤細胞相比較，耐藥細胞確實有EMT現(xiàn)象;并且耐藥細胞的遷移，侵襲以及體內(nèi)成瘤能力均強于親本細胞。
　　第二部分 E-cadherin對前列腺癌細胞耐藥性以及遷移、侵襲、克隆形成能力的影響
　　目的:
　　構(gòu)建E-cadherin沉默/過表達的細胞及其空載對照細胞，同時檢測構(gòu)建成功細胞和其親本細胞之間細胞功能學(xué)及形態(tài)學(xué)之間的差異以及對紫杉醇敏感性的差異，探索EMT在前列腺腫瘤耐藥機制中的作用。
　

7、　方法:
　　1.應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建E-cadherin過表達的前列腺腫瘤耐藥細胞PC3-TxR-E-cadherin，DU145-TxR-E-cadherin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株以及空載對照細胞株P(guān)C3-TxR-control，DU145-TxR-control，病毒液轉(zhuǎn)染48小時以后，加入嘌呤霉素篩選直至陰性對照組細胞全部死亡。Real-time PCR，Western-blot檢測E-cadherin表達，同時Western

8、-blot檢測和EMT相關(guān)的標記物以及和EMT相關(guān)的信號通路的表達。
　　2.劃痕實驗，Transwell小室實驗檢測E-cadherin過表達細胞株和空載細胞株以及親本耐藥細胞株之間遷移，侵襲能力的差異，MTS法檢測E-cadherin過表達細胞株和空載細胞株以及親本耐藥細胞株對紫杉醇敏感度的差異。
　　3.應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)，構(gòu)建E-cadherin瞬時沉默的的前列腺腫瘤細胞轉(zhuǎn)染細胞株P(guān)C3-si-E-cadheri

9、n，DU145-si-E-cadherin以及空載對照細胞株P(guān)C3-si-control，DU145-si-control，轉(zhuǎn)染48小時以后，提取mRNA及蛋白，然后Real-time PCR，Western-blot檢測E-cadherin表達，同時Real-timePCR檢測和EMT相關(guān)的標記物以及和Notch-1信號通路的表達。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建E-cadherin過表達的前列腺腫瘤耐藥細胞PC3-TxR-

10、E-cadherin，DU145-TxR-E-cadherin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株以及空載對照細胞株P(guān)C3-TxR-control,DU145-TxR-control，和親本細胞相比較 PC3-TxR-E-cadherin, DU145-TxR-E-cadherin中E-cadherin表達明顯升高，同時PC3-TxR-control, DU145-TxR-control和親本細胞相比較E-cadherin表達無變化;過表達細胞株中Vimen

11、tin, Claudin-1表達降低，Notch-1信號通路蛋白的表達明顯降低。
　　2.細胞36小時的細胞遷移率依次為:DU145-TxR,68.8±2.86％;DU145-TxR-control,66.6±2.88％; DU145-TxR-E-cadherin,38.3±1.63％;DU145-TxR細胞的遷移能力強于E-cadherin過表達細胞DU145-TxR-E-cadherin(P＜0.01)。Transwell實驗

12、顯示和親本耐藥細胞相比較E-cadherin過表達細胞24小時的侵襲和遷移能力都明顯降低(P＜0.01);MTS結(jié)果顯示72小時IC50依次為PC3-TxR,146.81±1.46nmol/L; PC3-TxR-control,139.13±4.60nmol/L; PC3-TxR-E-cadherin,96.2±15.03nmol/L; DU145-TxR,3831.9±65.69nmlo/L; DU145-TxR-control,37

13、25.45±87.36nmol/L; DU145-TxR-E-cadherin,3022.10±34.01 nmol/L。在兩種不同的E-cadherin過表達前列腺腫瘤耐藥細胞中，對紫杉醇的敏感性均強于其親本耐藥細胞(P＜0.05)。
　　3.和親本細胞相比較PC3-si-E-cadherin, DU145-si-E-cadherin中E-cadherin表達降低，同時PC3-si-control, DU145-si-contr

14、ol和親本細胞相比較E-cadherin表達無變化;PC3-si-E-cadherin, DU145-si-E-cadherin細胞中Vimentin, Snail表達升高，Notch-1信號通路的表達升高。
　　結(jié)論:
　　E-cadherin和前列腺腫瘤耐藥細胞的EMT發(fā)生密切相關(guān)，并影響前列腺腫瘤細胞及其耐藥細胞的侵襲，轉(zhuǎn)移以及克隆形成能力并且和紫杉醇耐藥性密切相關(guān)。
　　第三部分 Notch-1信號通路在EMT

15、所介導(dǎo)的前列腺癌耐藥機制中的作用
　　目的:
　　研究Notch-1信號通路在前列腺腫瘤細胞和EMT之間的關(guān)系以及在耐藥機制中的作用。
　　方法:
　　1.應(yīng)用Real-time PCR檢測在檢測E-cadherin過表達的前列腺腫瘤耐藥細胞株中Notch-1的表達，以及在E-cadherin沉默后的前列腺腫瘤細胞中的Notch-1的表達;
　　2.應(yīng)用Western-blot方法檢測γ-分泌酶的特異性抑制

16、劑(GSI)在不同濃度不同時間對前列腺腫瘤耐藥細胞中Notch家族成員的抑制效率;
　　3.MTS檢測GSI和紫杉醇聯(lián)合給藥對前列腺腫瘤耐藥細胞的紫杉醇耐受性是否有所恢復(fù);
　　結(jié)果:
　　1.在E-cadherin過表達的前列腺腫瘤耐藥細胞株中Notch-1表達下調(diào)在E-cadherin沉默后的前列腺腫瘤親本細胞中Notch-1表達上調(diào);
　　2.GSI在20μmol/L，72小時的時候明顯抑制PC3-TxR,

17、 DU145-TxR細胞中Notch-1的表達;20μmol/L，24小時的時候明顯抑制PC3-TxR,DU145-TxR細胞中Notch-4的表達;
　　3.紫杉醇和GSI(20μmol/L)聯(lián)合給藥72小時的IC50依次為:PC3-TxR+GSI=13.9±1.59nmol/L, DU145-TxR+GSI=838.0±134.4nmol/L;而紫杉醇單獨給藥72小時IC50依次為:PC3-TxR=191.2±11.9nmol