吖啶類衍生物MAPAT的抗腫瘤活性及其作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　對(duì)本課題組合成的吖啶酰胺基硫脲類衍生物MAPAT（2-甲氧基-9-吖啶（吡啶酰胺基）硫脲）進(jìn)行體外抗腫瘤活性篩選，初步探討其抗腫瘤活性的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用CCK-8法測定MAPAT對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549、人胰腺癌細(xì)胞株panc-1、人子宮癌細(xì)胞株Hela、人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SN-K、人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2細(xì)胞的增值抑制作用。
　　2.HE染色法觀察MAPAT作用后細(xì)胞形態(tài)的變化。

2、r>　　3.透射電鏡觀察腫瘤細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)變化。
　　4.Annexin FITC/PI標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡的影響。
　　5.細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)分析DNA倍體變化。
　　6.熒光定量PCR技術(shù)分析MAPAT對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶（TopoⅠ、Ⅱα、Ⅱβ）mRNA表達(dá)的影響。
　　7.蛋白印跡法分析MAPAT對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶（TopoⅠ、Ⅱα、Ⅱβ）蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1. CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MAPAT

3、對(duì)體外培養(yǎng)的5種腫瘤細(xì)胞CNE-2、panc-1、SN-K、A549以及Hela均有一定的抑制作用，MAPAT處理A549、CNE-2、panc-1、SN-K及Hela細(xì)胞48h的IC50分別是(8.90±0.49)?mol/L、(44.44±0.02)?mol/L、(133.54±0.87)?mol/L、(80.16±0.18)?mol/L、(92.77±0.12)?mol/L,其中對(duì)A549細(xì)胞的IC50最小,其IC50=8.90?

4、mol/L，當(dāng)26.77?mol/L時(shí)抑制率達(dá)到70％，故選取A549作為后續(xù)研究的細(xì)胞模型，設(shè)置低劑量組為4.45?mol/L、中劑量組為8.90?mol/L，高劑量組為26.77?mol/L。
　　2. HE染色結(jié)果可見隨著MAPAT的作用濃度增加，給藥組細(xì)胞生長密度較對(duì)照組依次降低，細(xì)胞間隙增大，并可見細(xì)胞收縮體積變小，核固縮藍(lán)色深染的凋亡形態(tài)學(xué)改變。
　　3.透射電鏡觀察結(jié)果顯示，MAPAT可誘導(dǎo)A549細(xì)胞的體積縮

5、小、核固縮、染色質(zhì)聚集的凋亡形態(tài)產(chǎn)生。細(xì)胞器空泡變形和細(xì)胞自噬，細(xì)胞器與細(xì)胞核的腫脹變形，使核膜受損，細(xì)胞變形壞死，細(xì)胞膜受損，細(xì)胞崩裂。
　　4.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MAPAT對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549作用48h后，低、中、高劑量組的壞死率分別為（2.63±0.21）%、(2.70±1.19)%、(38.80±0.10)%；與空白對(duì)照相比較，加藥組隨著MAPAT濃度增加，壞死率顯著增加（P＜0.01）；低劑量組、中劑量組凋亡率逐漸

6、增大（P＜0.05）。
　　5.細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與空白對(duì)照組相比，MAPAT對(duì)A549細(xì)胞作用48小時(shí)后，S期及G2/M期細(xì)胞明顯增加。
　　6.熒光定量PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MAPAT作用于A549后，與空白對(duì)照組相比，上調(diào)TopoⅡα在mRNA及蛋白水平的表達(dá)，下調(diào)TopoⅠ、TopoⅡβ在mRNA及蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　吖啶類衍生物MAPAT可抑制CNE-2、panc-