OTX2基因表達(dá)下調(diào)對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖和自噬影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　應(yīng)用靶向設(shè)計(jì)的OTX2基因小干擾RNA序列轉(zhuǎn)染小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1，下調(diào)OTX2基因的表達(dá)，研究對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖以及自噬水平的影響。
　　方法：
　　根據(jù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中小鼠的OTX2基因序列，設(shè)計(jì)靶向的三對(duì)小干擾RNA序列(OTX2-siRNA)。
　　常規(guī)培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞，將實(shí)驗(yàn)分為5組:OTX2-mus-868組，OTX2-mus-1027組，OTX2-m

2、us-1225組，陰性對(duì)照組，空白對(duì)照組。利用siRNA-mate轉(zhuǎn)染試劑對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48h后，對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色驗(yàn)證成骨細(xì)胞的干擾效率并分析陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，篩選出三對(duì)siRNA中干擾效率最優(yōu)的一組。采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定細(xì)胞增殖;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期;MDC熒光染色檢測(cè)細(xì)胞的自噬水平。利用SPSS21.0軟件對(duì)多組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。
　　結(jié)果：
　　1、免疫

3、細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)OTX2蛋白表達(dá)水平下調(diào)，細(xì)胞染色強(qiáng)度明顯減弱，陽(yáng)性細(xì)胞的百分比明顯減少，其中OTX2-mus-868組最為顯著，干擾效率最高，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　2、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組OD值小于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　3、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的S期所占的百分比減少，S期細(xì)

4、胞比率以及細(xì)胞的增殖指數(shù)小于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　4、MDC熒光染色結(jié)果顯示:熒光顯微鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)組染色強(qiáng)度弱，點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)少，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組染色強(qiáng)度強(qiáng)，點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)多。
　　結(jié)論：
　　1、OTX2-siRNA轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞，可以有效下調(diào)細(xì)胞內(nèi)OTX2蛋白表達(dá)水平。
　　2、OTX2基因表達(dá)下調(diào)可以引起MC3T3-E1細(xì)胞中S期細(xì)胞比例減小，抑制MC3T3