MicroRNA-7a在急性心肌梗死誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的功能調(diào)控機(jī)制與作用研究.pdf

1、本研究分四部分進(jìn)行論述:
　　第一部分:心肌梗死損傷對(duì)小鼠心肌細(xì)胞中Cdrlas和miR-7a表達(dá)水平的影響
　　目的：
　　1.明確小鼠梗死心肌組織中Cdrlas的表達(dá)水平是否發(fā)生變化;
　　2.確定小鼠梗死心肌組織中Cdrlas與miR-7a的表達(dá)變化是否一致;
　　3.探究缺氧培養(yǎng)條件下，小鼠心肌細(xì)胞中Cdrlas和miR-7a的表達(dá)變化是否一致。
　　方法：
　　1.MI小鼠模型建立

2、r>　　用0.8％戊巴比妥鈉麻醉小鼠，仰臥固定后，口腔放置氣管插管，沿胸骨左緣第四肋間隙剪開皮膚，行開胸手術(shù)。小心剪開心包后，永久性結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)，構(gòu)建MI小鼠模型。其中，假手術(shù)（sham）組小鼠同樣于LAD下穿線，但不結(jié)扎血管。
　　2.MI模型評(píng)價(jià)
　　術(shù)后24 h，檢測(cè)小鼠心室的心肌梗死面積、缺血危險(xiǎn)區(qū)比例，以及血清LDH含量。
　　3.細(xì)胞培養(yǎng)
　　將分離提取的小鼠原代心肌細(xì)胞和MCM心肌

3、細(xì)胞分別接種至含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、含5％ CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　4.缺氧處理與分組
　　常規(guī)培養(yǎng)心肌細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，接種至新鮮DMEM完全培養(yǎng)基中，分別置于含氧量為20％（對(duì)照）和0％的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　5.Real-time PCR檢測(cè)Cdrlas的表達(dá)
　　用Trizol試劑提取心肌組織和細(xì)胞中的總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用Cdrlas和β-act

4、in特異性引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。以β-actin為內(nèi)參基因，計(jì)算Cdrlas的表達(dá)水平。
　　6.Real-time PCR檢測(cè)miR-7a的表達(dá)
　　用TRIzol試劑提取心肌組織和細(xì)胞中的總RNA后，進(jìn)行miR-7a特異性反轉(zhuǎn)錄。
　　結(jié)果：
　　1.MI模型評(píng)價(jià)
　　與未出現(xiàn)心肌梗死的sham組小鼠相比，MI組小鼠左心室中的心肌梗死面積和缺血危險(xiǎn)區(qū)比例分別為60.0％和57.3％，提示小鼠MI

5、建模成功。而且，相較于sham組小鼠，MI組小鼠血清的LDH含量增加了約2.4倍。
　　2.MI促進(jìn)Cdrlas和miR-7a的表達(dá)上調(diào)
　　與sham組相比，MI術(shù)后6、12、24 h的小鼠心肌組織中的Cdrlas和miR-7a表達(dá)水平均顯著上調(diào)，并表現(xiàn)出一定的時(shí)間依賴性。選用MI術(shù)后24 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)觀察點(diǎn)。
　　3.缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中Cdrlas和miR-7a的表達(dá)增加
　　與正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞相比，缺氧

6、培養(yǎng)3、6、12h后，小鼠心肌細(xì)胞中的Cdrlas和miR-7a表達(dá)水平均顯著增加，并同樣表現(xiàn)出時(shí)間依賴性。選用缺氧培養(yǎng)12h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。
　　結(jié)論：
　　1.小鼠梗死心肌組織中Cdrlas的表達(dá)水平上調(diào)，且與miR-7a表達(dá)變化一致;
　　2.缺氧處理可以誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞中Cdrlas和miR-7a的共同高表達(dá)。
　　第二部分:MiR-7a通過調(diào)控PARP和SP1的表達(dá)影響缺氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡
　

7、　目的：
　　1.明確miR-7a是否靶向調(diào)控SP1的表達(dá);
　　2.探究PARP和SP1在miR-7a過表達(dá)減少缺氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　2.Real-time PCR檢測(cè)PARP和SP1 mRNA的表達(dá)水平
　　3.Western blot檢測(cè)PARP和SP1的蛋白表達(dá)水平
　　4.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)
　　5.Caspase-3活性檢測(cè)

8、
　　6.細(xì)胞凋亡檢測(cè)
　　缺氧處理各組MCM心肌細(xì)胞12h后，使用FITC AnnexinⅤ細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)各組MCM細(xì)胞的細(xì)胞凋亡比例。
　　結(jié)果：
　　1.miR-7a對(duì)PARP和SP13'UTR的靶向抑制
　　miR-7a過表達(dá)可以顯著降低PARP和SP1野生型報(bào)告基因組中的熒光素酶相對(duì)活性，相應(yīng)突變型報(bào)告基因載體組中的熒光素酶相對(duì)活性則無明顯變化。
　　2.miR-7a靶向調(diào)控PAR

9、P和SP1的表達(dá)
　　miR-7a過表達(dá)可以顯著降低PARP、SP1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。以上結(jié)果表明，PARP和SP1均為miR-7a的靶基因。
　　3.miR-7a通過抑制PARP和SP1表達(dá)，減少缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡
　　miR-7a過表達(dá)可以顯著降低缺氧誘導(dǎo)的caspase-3活性升高和細(xì)胞凋亡率增加。而進(jìn)一步過表達(dá)PARP和SP1可以逆轉(zhuǎn)miR-7a對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用。
　　結(jié)論：

10、
　　1.miR-7a可以靶向調(diào)控小鼠心肌細(xì)胞中PARP和SP1的表達(dá);
　　2.miR-7a通過抑制PARP和SP1的表達(dá)，減少缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。
　　第三部分:Cdrlas通過抑制miR-7a的靶向調(diào)控功能促進(jìn)小鼠心肌梗死
　　目的：
　　1.明確Cdrlas過表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響;
　　2.探究Cdrlas是否通過影響miR-7a靶基因PARP和SP1的表達(dá)，參與心肌細(xì)胞凋亡調(diào)控;

11、r>　　3.驗(yàn)證miR-7a在Cdrlas促進(jìn)小鼠心肌梗死中的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組
　　3.Real-time PCR檢測(cè)PARP和SP1 mRNA的表達(dá)水平
　　4.Western blot檢測(cè)PARP和SP1的蛋白表達(dá)水平
　　5.Caspase-3活性檢測(cè)
　　6.細(xì)胞凋亡檢測(cè)
　　結(jié)果：
　　1.Cdrlas過表達(dá)對(duì)miR-7a及其

12、靶基因表達(dá)水平的影響
　　轉(zhuǎn)染pcDNA-Cdrlas后，Cdrlas的表達(dá)水平上調(diào)了約2.3倍，表明Cdrlas過表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功。而且，Cdrlas過表達(dá)細(xì)胞株中，miR-7a的表達(dá)水平無明顯變化，miR-7a靶基因PARP和SP1的表達(dá)水平則均顯著增加。
　　2.miR-7a過表達(dá)對(duì)Cdrlas誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響
　　Cdrlas過表達(dá)可以顯著增加MCM心肌細(xì)胞的caspase-3活性和細(xì)胞凋亡率，誘導(dǎo)心

13、肌細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步過表達(dá)miR-7a，可以顯著降低Cdrlas誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，提示Cdrlas可能通過抑制miR-7a活性，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。
　　3.Cdrlas通過抑制miR-7a的靶向調(diào)控功能，促進(jìn)小鼠心肌梗死
　　體內(nèi)轉(zhuǎn)染pcDNA-Cdrlas后，MI小鼠的心肌梗死面積、缺血危險(xiǎn)區(qū)比例和血清LDH含量均顯著增加，并伴隨PARP和SP1的表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.miR-7a過表達(dá)抑制Cdrla

14、s誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡;
　　2.Cdrlas可以通過抑制miR-7a功能，上調(diào)靶基因PARP和SP1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)小鼠心肌梗死。
　　第四部分:姜黃素通過調(diào)控miR-7a表達(dá)保護(hù)小鼠心肌細(xì)胞避免心肌梗死損傷
　　目的：
　　1.確定姜黃素對(duì)MI小鼠的心肌保護(hù)作用;
　　2.研究姜黃素對(duì)MI小鼠心肌細(xì)胞中miR-7a和SP1表達(dá)水平的影響;
　　3.探究miR-7a在姜黃素保護(hù)心肌細(xì)胞避免MI損傷中的

15、作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.姜黃素給藥與MI小鼠模型建立
　　2.細(xì)胞培養(yǎng)
　　3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組
　　4.Real-time PCR檢測(cè)miR-7a的表達(dá)水平
　　5.Real-time PCR檢測(cè)SP1 mRNA的表達(dá)水平
　　6.Western blot檢測(cè)SP1的蛋白表達(dá)水平
　　7.Caspase-3活性檢測(cè)
　　8.細(xì)胞凋亡檢測(cè)
　　結(jié)果：
　　1.姜黃素

16、對(duì)心梗后心肌損傷和miR-7、SP1表達(dá)水平的影響
　　姜黃素給藥可以顯著降低MI小鼠的心肌梗死面積、缺血危險(xiǎn)區(qū)比例和血清LDH含量，減弱MI引發(fā)的心肌細(xì)胞損傷。
　　2.姜黃素對(duì)缺氧誘導(dǎo)的MCM細(xì)胞凋亡的影響
　　姜黃素預(yù)處理可以顯著降低缺氧誘導(dǎo)的caspase-3活性升高和凋亡細(xì)胞比例增加，減少缺氧誘導(dǎo)的MCM細(xì)胞凋亡。
　　3.miR-7a或SP1對(duì)姜黃素抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響
　　姜黃素對(duì)缺氧

17、誘導(dǎo)的caspase-3活性升高和凋亡細(xì)胞比例增加的抑制作用，均可被miR-7a干擾或SP1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)。
　　4.miR-7a干擾可以取消姜黃素對(duì)缺氧誘導(dǎo)的SP1表達(dá)增加的抑制作用
　　姜黃素對(duì)缺氧誘導(dǎo)的SP1表達(dá)增加的抑制作用，也可被miR-7a干擾逆轉(zhuǎn)，提示miR-7a通過調(diào)控SP1的表達(dá)參與姜黃素的心肌保護(hù)作用調(diào)控。
　　結(jié)論：
　　1.miR-7a可以調(diào)控缺氧誘導(dǎo)的SP1表達(dá)變化
　　2.姜黃素通過