基于TREM-1-DAP12信號通路探索雷公藤甲素治療膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠的機理.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以對稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性全身性自身免疫性疾病，基本病理改變?yōu)榛ぱ祝曰ぜ毎鲋?、炎性細胞浸潤、血管翳形成以及軟骨和骨的進行性破壞為特征，是一種難治性疾病。雷公藤甲素(triptolide，TP)是從雷公藤中分離出的一種環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，被認為是雷公藤主要的抗炎和免疫抑制成分之一。現(xiàn)代研究和臨床試驗也表明其具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等多種生物活性。與此

2、同時，疾病的發(fā)生和發(fā)展具有復(fù)雜性，所以TP治療RA的具體作用機制仍然需要我們進一步研究。
　　目的:
　　本研究旨在借助生物信息學(xué)技術(shù)，并結(jié)合體內(nèi)外實驗驗證，探討TP通過TREM-1/DAP12信號通路抗炎的作用，進一步闡釋TP治療RA的分子機制。
　　方法:
　　1.利用Pubchem和NCBI Gene公共數(shù)據(jù)庫分別查找TP的人類靶蛋白和RA人類相關(guān)基因;并借助IPA生物網(wǎng)絡(luò)分析平臺構(gòu)建TP靶蛋白與RA疾病的

3、相互作用網(wǎng)絡(luò)，進一步分析其相互作用網(wǎng)絡(luò)的功能及相關(guān)的生物學(xué)通路，最終預(yù)測TP治療RA的優(yōu)勢生物學(xué)通絡(luò)及關(guān)鍵分子靶點。
　　2.進行體內(nèi)體外實驗驗證。(1)體外實驗:通過LPS刺激經(jīng)PMA誘導(dǎo)的U937細胞建立炎癥巨噬細胞模型，研究TP通過TREM-1信號通路調(diào)控炎性因子如TNF-α，IL-1β，IL-6釋放的作用。通過TREM-1 siRNA抑制TREM-1的表達，檢測抑制TREM-1的表達后TP是否依然可以降低TNF-α，IL-

4、1β，IL-6等炎癥因子的表達。(2)體內(nèi)實驗:通過復(fù)制Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎動物模型，對TP通過于TREM-1信號通路調(diào)控炎癥反應(yīng)，進一步達到治療RA的作用進行動物實驗驗證。
　　結(jié)果：
　　1.在Pubchem公共數(shù)據(jù)庫中共檢索到TP人類靶蛋白8個，在Gene數(shù)據(jù)庫中共檢索到與RA相關(guān)的人類基因832個。
　　2.生物信息學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):RA疾病信號通路主要涉及細胞免疫、體液免疫、細胞因子和第二信使信號四個方面，

5、TP靶蛋白參與的信號通路主要涉及細胞免疫和細胞因子信號，這提示TP靶蛋白與RA人類基因參與的信號通路有重疊。進一步使用生物信息學(xué)分析平臺的比較分析功能，依據(jù)TP參與權(quán)重排列，對TP靶蛋白和RA基因共同參與調(diào)控的生物學(xué)通路比較分析。我們發(fā)現(xiàn)TP與RA共同參與的前10條信號通路中，TREM-1信號通路是居于首位的，這提示我們，TP可能是通過TREM-1信號通路來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，進一步達到治療RA的效果。
　　3.體外實驗結(jié)果顯示:用10

6、0 ng/mL LPS分別刺激不同時間以后，在實驗測定的時間范圍內(nèi)，U937細胞中TREM-1 mRNA的表達水平隨刺激時間的增加而升高，并且在LPS刺激48 h后TREM-1的表達水平最高;且與LPS組相比，TP能明顯降低經(jīng)PMA誘導(dǎo)和LPS刺激的U937細胞膜上TREM-1的表達，能降低細胞中TREM-1，DAP12 mRNA和蛋白的表達水平，同時能夠抑制JAK2和STAT3的磷酸化表達。與正常組相比，經(jīng)LPS刺激后，細胞上清中TN

7、F-α，IL-1β，IL-6的表達水平明顯升高(P＜0.01，P＜0.05)，而TP則能明顯降低TNF-α，IL-1β，IL-6的表達（P＜0.01，P＜0.05）。
　　4.抑制實驗結(jié)果顯示:用TREM-1 siRNA抑制TREM-1后，與正常組相比，細胞中TREM-1的表達有明顯下降（P＜0.05）;與模型組相比，抑制TREM-1后TNF-α，IL-1β，IL-6的表達下降，抑制TREM-1后再用TP作用也可以降低上述細胞因子

8、的表達，但單純抑制TREM-1組與抑制TREM-1后再用TP作用組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　5.關(guān)節(jié)腫脹及組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示:模型組大鼠的AI評分明顯高于正常組(P＜0.01)，TP和LEF均能明顯緩解CIA大鼠的關(guān)節(jié)腫脹程度。給藥的第9天，TH，TL，LEF組的AI值開始低于模型組（P＜0.05）。用藥15天后，各給藥組大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度均明顯下降（P＜0.01，P＜0.05），TH組的下降趨勢最明顯。通過病理學(xué)的觀察和分析，各給

9、藥組大鼠的踝關(guān)節(jié)病理狀況都有不同程度的緩解，特別是TH組有更明顯的緩解。
　　6.TREM-1，DAP12及細胞因子水平結(jié)果顯示:與正常組相比，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)中TREM-1，DAP12的mRNA表達水平及JAK2，STAT3的磷酸化水平明顯升高(P＜0.01，P＜0.05)，而各給藥組大鼠踝關(guān)節(jié)中TREM-1，DAP12的mRNA的表達水平和JAK2，STAT3的磷酸化水平則明顯下降。同時，模型組大鼠血清和踝關(guān)節(jié)中TNF-α，I

10、L-1β，IL-6的表達水平明顯高于正常組(P＜0.01，P＜0.05);與模型組相比，各給藥組大鼠血清和踝關(guān)節(jié)中TNF-α，IL-1β，IL-6的表達水平則明顯下降（P＜0.05），TH組下降的最明顯（P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.我們采用生物信息學(xué)方法分析TP作用于RA的新靶點及可能的作用機制，且分析的部分結(jié)果與目前的研究有重合，說明這種新的研究方法有一定的可靠性，這可以為以后的研究提供新思路和新方法;