從Treg-Th17角度探討羌活二黃湯治療大鼠佐劑性關節(jié)炎的機制.pdf

1、類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以對稱性、小關節(jié)病變?yōu)橹鞯穆?、進行性、破壞性自身免疫性疾病。在關節(jié)滑膜局部有CD4+T細胞浸潤，并在特定遺傳背景和局部炎癥微環(huán)境下，CD4+T細胞功能呈現(xiàn)異常，是致使RA滑膜炎癥的誘發(fā)和加重的中心環(huán)節(jié)。隨著對CD4+T細胞其中的兩種亞型Th17(T-helper17 cells)與Treg(Regulatory T cells)細胞認識的不斷深入，目前認為Treg細胞與T

2、h17細胞失衡可能是導致RA發(fā)病的重要原因之一。
　　目前，臨床上治療RA的藥物主要有非甾體類抗炎藥、改變病情抗風濕藥、糖皮質(zhì)激素、生物制劑等。這些藥物均有一定療效，但由于具有較大毒副反應或高昂的花費，病人難以長期使用。羌活二黃湯（羌活獨活秦艽薏苡仁忍冬藤黃芩姜黃莪術川芎甘草）為我科常用的治療RA的中藥復方，有較好的臨床療效，副作用小。其作用機制有待于深入研究。
　　目的：
　　以AA(adjuvant arthrit

3、is，AA)大鼠為模型，研究不同劑量的羌活二黃湯的治療效果，并從Treg/Th17細胞的角度探討羌活二黃湯的治療機制。
　　方法：
　　一、羌活二黃湯對大鼠佐劑性關節(jié)炎的治療效果
　　1、佐劑性關節(jié)炎大鼠模型建立及評價
　　(1)使用滅活結(jié)核桿菌與礦物油混合的佐劑于大鼠尾根部注射0.2mL(1mg/只)，連續(xù)觀察。
　　(2)模型的評價系統(tǒng):0分→正常;1分→1個趾關節(jié)紅腫;2分→至少2個趾關節(jié)或整個足爪輕

4、度紅腫;3分→足爪紅腫較重;4分→足爪重度紅腫，缺乏彈性?？傇u分為每只大鼠足爪的評分的總和?？傇u分大于1分為模型建立成功。
　　2、不同劑量的羌活二黃湯對大鼠佐劑性關節(jié)炎的治療效果
　　(1)將造模成功的30只大鼠隨機分為5組，即:生理鹽水對照組（模型組，2mL/100g體重）、甲氨喋呤組（每周0.4mg/kg）、羌活二黃湯高劑量組(18g/(kg·d))、羌活二黃湯中劑量組(9g/(kg·d))、羌活二黃湯低劑量組(4.5

5、g/(kg·d)）。另設正常對照組，為6只正常大鼠。各組大鼠常規(guī)給藥，隔天觀察記錄每只大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分、體重、足掌厚度、踝關節(jié)周徑的變化。
　　(2)以各組大鼠脾淋巴細胞為對象，使用CCK-8試劑盒，檢測各組大鼠脾淋巴細胞增殖情況。
　　3、不同劑量的羌活二黃湯對佐劑性關節(jié)炎大鼠組踝關節(jié)的滑膜、血管的影響
　　以各組大鼠踝關節(jié)為對象，蘇木精-伊紅常規(guī)染色，于顯微鏡下觀察各組大鼠關節(jié)滑膜變化。
　　二、從Treg

6、/Th17角度探討羌活二黃湯對佐劑性關節(jié)炎的治療機制
　　1、流式細胞技術檢測大鼠脾CD4+CD25+CD127-Treg細胞、CD4+IL-17A+Th17細胞的百分比。
　　2、ELISA方法檢測血清IL-6、IL-17、TNF-α、TGF-β的含量。
　　結(jié)果：
　　1.造模后大鼠第3天在注射部位可出現(xiàn)紅斑，并逐漸出現(xiàn)潰瘍，約第5天可見尾部結(jié)節(jié)，第8-10天可出現(xiàn)部分足趾的紅腫，踝關節(jié)及整個足爪的腫脹可在第

7、16天出現(xiàn)。以總的關節(jié)炎評分大于1分為造模成功。踝關節(jié)組織病理HE染色示關節(jié)滑膜增生明顯，甚至整個關節(jié)腔被關節(jié)滑膜填充，可見關節(jié)軟骨破壞，大量新生血管翳。建模成功率為75％。
　　2.與模型組比較，甲氨蝶呤組、中藥高劑量組在給藥后第24及28天時能夠降低大鼠關節(jié)炎指數(shù)評分(P＜0.01)，減輕大鼠關節(jié)炎癥。
　　3.與模型組比較，甲氨蝶呤組、中藥高劑量組在給藥后第24及28天時大鼠體重增加較模型組快(P＜0.05)。

8、　　4.與模型組相比，甲氨蝶呤組、中藥高劑量組在給藥后第24天及28天時足掌厚度減少，足掌腫脹減輕，炎癥緩解(P＜0.05)。
　　5.與模型組相比，甲氨蝶呤組在給藥后第20、24及28天時大鼠足踝關節(jié)周徑減少(P＜0.05)，中藥高劑量組在給藥后第28天時關節(jié)周徑為（（2.84±0.29）cm，P=0.006）。
　　6.無論在PMA刺激后24h、48h還是72h，甲氨喋呤及中藥高劑量組較模型組均能明顯抑制脾淋巴細胞的增殖

9、(P＜0.01)。
　　7.與正常對照組比較，模型組脾淋巴Treg細胞百分比降低（（5.75±0.46）％，P=0.000），而Th17百分比明顯增高（（1.84±0.45）％，P=0.004），呈失衡狀態(tài)。經(jīng)高劑量中藥干預后，大鼠脾淋巴Treg細胞百分比顯著上升（（11.19±2.01）％，P=0.000），Th17百分比下降（（0.98±0.35）％，P=0.041）。與模型組相比，中藥中、低劑量組無明顯治療效果(P＞0.05

10、)。
　　8.與正常對照組相比，模型組血清IL-6（（134.21±16.58）pg/mL，P=0.000）、IL-17((36.26±5.62) pg/mL,P=0.001)、TNF-僅((540.01±36.94) pg/mL, P=0.013)的含量明顯增高，而TGF-β的含量降低（（41.81±6.35）pg/mL，P=0.020）。與模型組相比，經(jīng)甲氨蝶呤、高劑量中藥干預后，血清IL-6、IL-17A及TNF-α含量明顯