PI3K-Akt-mTOR通路在鎘致BRL3A細(xì)胞自噬中的作用.pdf

1、自噬是應(yīng)激介導(dǎo)的溶酶體參與分解細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)的過(guò)程，其與機(jī)體正常發(fā)育、衰老、延長(zhǎng)壽命、免疫和防御微生物侵襲等過(guò)程有關(guān)。應(yīng)激條件下，自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和能量平衡的重要過(guò)程。鎘(Cd)是一種重要的環(huán)境和職業(yè)污染物，可引起多種器官損傷，其中肝臟是重要的靶器官。研究表明，鎘可引起多種細(xì)胞自噬水平上升，但具體的作用機(jī)制尚不是十分清楚。本試驗(yàn)以大鼠肝細(xì)胞系(BRL3A)為研究模型，探究鎘對(duì)BRL3A細(xì)胞自噬水平的影響;自噬在鎘致BRL3

2、A細(xì)胞損傷中的作用;以及PI3K/Akt/mTOR通路在鎘致BRL3A細(xì)胞自噬中的作用，從而為進(jìn)一步闡明鎘致肝臟毒性機(jī)理提供理論依據(jù)。
　　1.鎘對(duì)BRL3A細(xì)胞自噬的影響
　　為了探究鎘對(duì)BRL3A細(xì)胞自噬水平的影響，采用不同濃度的醋酸鎘(0、2、4、8、16μmol/L)處理細(xì)胞4h，免疫印跡法檢測(cè)自噬體標(biāo)志性蛋白LC3表達(dá)。8μmol/L鎘處理細(xì)胞4h后，免疫熒光法觀察LC3聚點(diǎn)現(xiàn)象，單丹磺酰尸胺(MDC)染色觀察晚期

3、自噬溶酶體。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，隨著鎘濃度的升高，細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ含量先上升后下降，8μmol/L時(shí)，LC3-Ⅱ含量最高，差異顯著或極顯著（P＜0.05或P＜0.01）;免疫熒光與MDC染色結(jié)果都表明鎘可以引起細(xì)胞自噬溶酶體數(shù)量明顯增多。以上結(jié)果說(shuō)明鎘可以引起B(yǎng)RL3A細(xì)胞自噬水平上升。
　　2.自噬在鎘致BRL3A細(xì)胞損傷中的作用
　　為了探究自噬在鎘致BRL3A細(xì)胞損傷中的作用，通過(guò)添加雷帕霉素(50nmol/L)和

4、氯喹（5μmol/L）來(lái)升高和降低細(xì)胞自噬水平，MTT法檢測(cè)自噬水平的變化對(duì)細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果表明，與鎘處理組相比，自噬水平的上升可以顯著提高細(xì)胞存活率(P＜0.05)，自噬水平的下降顯著降低細(xì)胞存活率(P＜0.05)。這些結(jié)果說(shuō)明自噬對(duì)鎘致BRL3A細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。
　　3.PI3K/Akt/mTOR通路在鎘致BRL3A細(xì)胞自噬中的作用
　　為了探究PI3K/Akt/mTOR通路在鎘致BRL3A細(xì)胞自噬中的

5、作用，分別用0、2、4、8μmol/L的醋酸鎘處理細(xì)胞4h，免疫印跡法檢測(cè)PI3K/Akt/mTOR通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平;加入PI3K抑制劑LY294002（40μmol/L）與8μmol/L醋酸鎘單獨(dú)或聯(lián)合處理細(xì)胞4h，檢測(cè)Akt蛋白磷酸化水平和LC3含量的變化，MDC染色觀察晚期自噬溶酶體的變化。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，隨著鎘濃度的上升，PI3K、Akt、mTOR、P70S6K蛋白的磷酸化水平逐漸下降;8μmol/L時(shí)各蛋白磷