YAP在哮喘發(fā)生過程中的表達情況及其功能探討.pdf

1、目的：
　　哮喘的主要特點是炎癥細胞的浸潤和組織重構與結構變化，其中包括氣管上皮纖維化和ASM細胞增殖。Hippo通路是一個關鍵的哮喘機制，主要監(jiān)管并參與細胞增殖，成纖維細胞和平滑肌細胞分化。
　　為了揭示哮喘和 Hippo之間是否存在顯著性的關系，作為 Hippo通路機制中最重要的基因靶點-YAP蛋白的表達，則是主要的指針。我們通過慢性哮喘的支氣管平滑肌模型(CAM)對該蛋白的表達進行了研究。
　　方法：
　　

2、1：40只小鼠隨機分為空白對照組和模型實驗組（利用雞卵清蛋白(OVA)誘喘制成慢性哮喘的支氣管平滑肌模型）。模型建立之后，通過HE染色法對空白對照組和模型實驗組的老鼠在肺組織的病理變化方面進行觀察。用免疫組織化學(IHC)的方法檢測是否存在YAP肺組織蛋白表達。
　　2：通過構建shRNA抑制YAP在mRNA和蛋白水平上的特異性表達，研究溶血性脂肪酸流（LPA）和鞘氨醇-1-磷酸鹽（S1P）通過對YAP以及人氣道平滑肌細胞（air

3、way smooth muscle cells，ASMCs）的影響。
　　結果：
　　模型實驗組的病理變化表明，經(jīng)過誘喘的小鼠存在大量炎癥細胞浸潤的現(xiàn)象，主要包括淋巴細胞和嗜酸性粒細胞的浸潤，還存在特定的氣道平滑肌增生的現(xiàn)象；
　　IHC結果表明，模型實驗組與空白對照組的YAP蛋白質(zhì)在表達中相比，有顯著增加(P<0.01)。這一結果進一步證實了通過實時定量PCR(qPCR)和免疫印跡手段分析檢測到的YAP基因(P<0.

4、01)表達在模型實驗組是有上調(diào)證據(jù)的準確性；
　　實驗結果也顯示，被 shYAP慢病毒條件轉染24h及以上的時間可以發(fā)現(xiàn)shYAP慢病毒轉染對ASMCs細胞內(nèi)YAP表達的抑制效應，即轉染是成功的，其質(zhì)粒也是有效的；
　　而采用LPA和S1P對細胞的長期以及短期的干預均能夠增加ankrd1基因及其下游基因CTGF的表達，從而顯著的增加YAP的活性；采用shyap抑制YAP細胞的表達，然后加入對ASMCs干預LPA和S1P，結果

5、發(fā)現(xiàn)shyap轉染CTGF和ankrd1，YAP和PCNA的表達減少，當YAP受到抑制時，細胞的增殖也一定程度的受到影響；
　　最后采用流式細胞儀檢測YAP對ASMCs細胞周期的實驗中發(fā)現(xiàn)YAP的活性與細胞S期以及G2/M的細胞量存在著一定的相關性，即YAP活性越高，處于S期以及G2/M的細胞量就會越多，進一步說明YAP能夠促進細胞的增殖。
　　結論：
　　總之，與空白對照組相比，在哮喘中，YAP蛋白具有明顯表達，同時