Transwell間接共培養(yǎng)條件下成骨細(xì)胞向脂肪細(xì)胞橫向分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:探討在Transwell間接共培養(yǎng)體系條件下，將成熟脂肪細(xì)胞作為誘導(dǎo)因素，觀察成骨細(xì)胞成脂橫向分化的可能性，為下一步進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和進(jìn)一步臨床治療提供參考。
　　方法:1．將3T3-L1小鼠成纖維樣前體細(xì)胞傳至3代，選取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞加入成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)10d，用油紅O染色鑒定其為成熟脂肪細(xì)胞后，將成熟脂肪細(xì)胞作為誘導(dǎo)因素來(lái)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞。傳代至第3代的MC3T3-E1小鼠成骨樣細(xì)胞設(shè)立為實(shí)驗(yàn)組。選取上室下室面積之比為1:4，插入式

2、Transwell培養(yǎng)板，將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和小鼠成熟脂肪細(xì)胞組細(xì)胞分別種于Transwell體系的上室和下室，并記為0d，對(duì)照組為用低糖DMEM單獨(dú)培養(yǎng)的MC3T3-E1小鼠成骨樣細(xì)胞。2．油紅O染色實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組7d、14d、21d3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的脂滴染色情況；3．茜素紅染色檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞在7d、14d、21d3個(gè)時(shí)間點(diǎn)鈣化結(jié)節(jié)量的表達(dá)情況；4．以脂肪條件培養(yǎng)基（FCCM）培養(yǎng)基及低糖 DMEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng)小鼠成骨樣細(xì)胞，以

3、MTT法在0h、24h、36h3個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)胞增殖抑制率；5．檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞在7d、14d、21d3個(gè)時(shí)間點(diǎn)甘油三酯（TG）相對(duì)含量表達(dá)；6．Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞在7d、14d、21d3個(gè)時(shí)間點(diǎn)成脂目的蛋白PPARγ2的表達(dá)含量。7．?dāng)?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS19.0軟件分析，使用方差分析進(jìn)行組內(nèi)及組間的差異性比較、分析，以α=0.05作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，P<0.05表示

4、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1．鏡下觀察結(jié)果：成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)10d，前體脂肪細(xì)胞的形態(tài)由成纖維樣變?yōu)閳A形，胞質(zhì)內(nèi)脂滴聚集，經(jīng)油紅O染色后，鑒定為成熟脂肪細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞共培養(yǎng)7d細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)脂滴，14d時(shí)細(xì)胞呈成纖維樣，胞質(zhì)內(nèi)逐漸出現(xiàn)黑色顆粒物質(zhì)及少量脂滴，培養(yǎng)至21d，部分細(xì)胞由成纖維樣變?yōu)闄E圓形或圓形，胞質(zhì)內(nèi)脂滴增多；對(duì)照組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)容及細(xì)胞形態(tài)未有明顯改變；
　　2．油紅O實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞染色區(qū)呈遞增

5、趨勢(shì)，對(duì)照組細(xì)胞染色區(qū)無(wú)明顯變化；
　　3．茜素紅染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞自7d、14d、21d呈鈣結(jié)節(jié)量表達(dá)減少的趨勢(shì)；對(duì)照組細(xì)胞在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)則無(wú)明顯變化，呈大片著色區(qū)；
　　4．MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組抑制率分別為0h組(0.1947±0.09)％、24h組(64.917±2.4)%、36h組(71±2.3)%，對(duì)照組抑制率為0h組(0.1735±0.05)%、24h組(23.33±3.4)%、36h組(56.33±1

6、)%，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比及實(shí)驗(yàn)組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），對(duì)照組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　5．TG相對(duì)含量檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞甘油三酯聚集量呈遞增趨勢(shì)，隨時(shí)間的增長(zhǎng)而增多，實(shí)驗(yàn)組TG表達(dá)量為7d組(0.20167±0.015)、14d組(0.25167±0.024)、21d組(0.58167±0.023)，對(duì)照組的表達(dá)量為7d組(0.22±0.027)、14d組(0.19667±0.025)

7、、21d組(0.24±0.042)，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組組間相比及實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P<0.05），對(duì)照組組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；
　　6．Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞PPARγ2蛋白表達(dá)量在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)呈遞增趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組目的蛋白表達(dá)量為7d組(0.245±0.012)、14d組(0.40817±0.0365)、21d組(0.759±0.039)，對(duì)照組的表達(dá)量為7d組(0.2781±

8、0.043)、14d組(0.2955±0.022)、21d組(0.3849±0.03)，而成熟脂肪細(xì)胞的目的蛋白表達(dá)量為7d組(0.9905±0.32)、14d組(1.1259±0.65)、21d組(0.98999±0.25)，實(shí)驗(yàn)組組間相比，實(shí)驗(yàn)組與成熟脂肪細(xì)胞組相比，以及實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論:1．在Transwell間接共培養(yǎng)體系中，成骨細(xì)胞在成熟脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)下呈現(xiàn)出成脂橫向分化趨