miRNA-20a靶向ATG16L1和ATG7抑制細胞自噬介導BCG的存活.pdf

1、目的：研究miR-20a對自噬基因ATG16L1和ATG7的靶向調控作用，及其通過調控細胞自噬介導結核分枝桿菌在巨噬細胞胞內存活的影響。
　　方法：1.利用雷帕霉素、3-MA和BCG處理RAW264.7細胞后，采用qRT-PCR檢測miR-17-92簇中miR-20a等6種miRNAs的表達量；通過生物信息學軟件分析miR-20a對自噬基因ATG16L1和ATG7靶向調控作用。
　　2.分別將ATG16L13’UTR和ATG

2、73’UTR及其突變體克隆到pMIR-Report質粒中，通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)和Western blot，驗證miR-20a對ATG16L1和ATG7的靶向調控作用。
　　3.將miR-20a mimic和miR-20a inhibitor分別轉染到RAW264.7細胞中，同時利用雷帕霉素與BCG刺激后，通過激光共聚焦顯微鏡、透射電鏡、Western blot方法分別檢測自噬小體分布及自噬相關蛋白表達水平，研究miR-20a對自

3、噬過程的調控作用。
　　4.將miR-20a mimic和miR-20a inhibitor分別轉染到RAW264.7細胞中，同時用BCG和雷帕霉素處理細胞，利用qRT-PCR檢測各組細胞中BCG的存活量。研究miR-20a對巨噬細胞內BCG存活量的調控作用。
　　結果：1.與對照組相比，雷帕霉素組RAW264.7細胞的miR-17、miR-18a、miR-20a表達水平顯著上調（P<0.05）；3-MA組RAW264.7細

4、胞的miR-20a表達水平顯著下調（P<0.05）。與對照組相比，BCG感染細胞6h時，miR-20a的表達水平升高約8倍（P<0.01）。感染時間的延長至48h時，miR-20a的表達水平較之前有所下降，但仍高于對照組（P<0.05)。
　　2.生物信息學分析表明，ATG16L1和ATG7是miR-20a的靶基因。雙熒光素酶報告系統(tǒng)結果顯示，轉染miR-20a mimic可明顯抑制ATG16L1的相對熒光素酶活性，其活性下降約1

5、.8倍(P＜0.05)；而轉染ATG16L1-mut組相對熒光素酶活性沒有明顯變化。轉染miR-20a mimic組ATG7的相對熒光素酶活性受到明顯抑制，下降約1.6倍(P＜0.05)；而ATG7-mut組相對熒光素酶活性沒有明顯變化。
　　結果：表明，miR-20a可與ATG16L13′-UTR和ATG73′-UTR特異性結合抑制其表達。Western blot結果顯示，miR-20a mimic能明顯抑制ATG16L1和AT

6、G7蛋白的表達，而miR-20a inhibitor組ATG16L1和ATG7蛋白表達量明顯升高（P＜0.05），結果表明miR-20a可在轉錄后水平抑制ATG16L1和ATG7的表達。
　　3.細胞免疫熒光和透射電鏡實驗結果表明，轉染miR-20a mimic組自噬小體標志蛋白LC3均勻分布于細胞質當中，自噬小體數(shù)量明顯減少；相反，miR-20a inhibitor組細胞內的點狀自噬小體明顯增多。Western blot檢測LC

7、3的表達水平，結果顯示，與對照組相比，miR-20a mimic組LC3-II表達量明顯減少，LC3II/LC3I比值降低；miR-20a inhibitor組LC3II表達量明顯升高,LC3II/LC3I比值升高；結果表明，miR-20a可以通過靶向抑制ATG16L1和ATG7的表達抑制BCG介導的細胞自噬過程。
　　4.在RAW264.7細胞中轉染miR-20a mimic、inhibitor、靶基因siRNA，并向每組細胞中

8、加入1×107/L的BCG共培養(yǎng)24h。實時熒光定量PCR檢測BCG存活量，結果顯示，miR-20a mimic組的BCG存活量顯著高于正常組（P＜0.01），反之，轉染miR-20a inhibitor后BCG存活量顯著低于正常組（P＜0.01）。表明miR-20a可促進BCG在巨噬細胞中的存活。
　　結論：1.miRNA-20a可靶向抑制ATG16L1和ATG7蛋白的表達，抑制細胞的自噬水平，負向調控RAW264.7巨噬細胞的