Kruppel樣因子15對(duì)大鼠心臟壓力超-卸負(fù)荷后脂質(zhì)沉積及心功能的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、R541.04
　　.04？
　　目的:風(fēng)濕性主動(dòng)脈瓣狹窄是臨床常見的導(dǎo)致左心室超負(fù)荷的疾病，主動(dòng)脈瓣膜替換術(shù)是典型的卸負(fù)荷過程。但通過手術(shù)解除心室負(fù)荷并不能使所有患者心功能得到有效的改善。前期研究發(fā)現(xiàn)，KLF15可以調(diào)節(jié)糖異生，調(diào)節(jié)骨骼肌脂質(zhì)運(yùn)用，協(xié)調(diào)生理體內(nèi)氮平衡，心臟脂質(zhì)代謝的一個(gè)重要調(diào)節(jié)器，聯(lián)系內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和胰島素抵抗，KLF15缺乏對(duì)心力衰竭和動(dòng)脈瘤形成也有密切關(guān)系。
　　脂質(zhì)在心肌組織中蓄積可以產(chǎn)生毒性作用，

2、從而影響心臟功能。本研究結(jié)合前期研究，建立大鼠主動(dòng)脈瓣上縮窄-松解模型，探尋心臟慢性壓力超/卸負(fù)荷后心臟脂質(zhì)代謝變化，探討KLF15對(duì)心臟脂質(zhì)代謝變化的調(diào)節(jié)作用，為臨床上左心室超負(fù)荷疾病患者術(shù)后提供一種新的輔助治療方法。
　　方法:1.動(dòng)物分組:A1.SD大鼠行升主動(dòng)脈縮窄術(shù)9周后并行心臟彩超后處死大鼠取出心臟;A2: SD大鼠行升主動(dòng)脈縮窄術(shù)12周后并行心臟彩超處死大鼠取出心臟;A3:SD大鼠行升主動(dòng)脈縮窄術(shù)15周后并行心臟彩超

3、處死大鼠取出心臟。B1:SD大鼠行升主動(dòng)脈縮窄術(shù)9周后去縮窄當(dāng)天行心臟彩超并處死大鼠取心臟;B2: SD大鼠行升主動(dòng)脈縮窄術(shù)9周去縮窄3周后行心臟彩超并處死大鼠取心臟;B3: SD大鼠行升主動(dòng)脈縮窄術(shù)9周去縮窄6周后行心臟彩超并處死大鼠取心臟。C1: SD大鼠只開胸，游離升主動(dòng)脈不縮窄處理后又關(guān)閉胸腔，飼養(yǎng)9周后行心臟彩超并處死取心臟;C2: SD大鼠只開胸，游離升主動(dòng)脈不縮窄處理后又關(guān)閉胸腔，飼養(yǎng)12周后行心臟彩超并處死取心臟;C3:

4、 SD大鼠只開胸，游離升主動(dòng)脈不縮窄處理后又關(guān)閉胸腔，飼養(yǎng)15周后行心臟彩超并處死取心臟。
　　2.大鼠心臟超/卸負(fù)荷模型的建立:由胸骨上角路徑顯露升主動(dòng)脈。以3-0Prolene滑線環(huán)繞升主動(dòng)脈后打一個(gè)活結(jié)，把直徑為1.4mm鋼絲置于活的線結(jié)內(nèi)與升主動(dòng)脈平行排列后并放置一塊約0.2cm×0.5cm墊片收緊線結(jié)并立即撤出鋼絲，墊片這時(shí)已經(jīng)在線結(jié)內(nèi)，即制造出升主動(dòng)脈狹窄。去縮窄術(shù)手術(shù)路徑與縮窄術(shù)相同，找到墊片剪掉結(jié)扎線結(jié)即完成松解。

5、
　　3.心臟超聲心動(dòng)圖檢查:采用小動(dòng)物超聲機(jī)(VEVO2100 Imaging system)，選用探頭頻率21MHz，于升主動(dòng)脈縮窄9周后篩選合格左心室壓力超負(fù)荷模型以及升主動(dòng)脈去縮窄術(shù)后3、6周后各組通過M型超聲測量以下數(shù)據(jù):ejection fraction(EF)、fractionalshortening(FS)。
　　4.心肌中游離脂肪酸含量的測定根據(jù)脂肪酸試劑盒說明書檢測心肌組織中游離脂肪酸含量，最后將所得混合

6、液至于酶標(biāo)儀中檢測570nm的吸收光，然后進(jìn)行色度分析。
　　5.組織病理學(xué)觀察:取出心臟經(jīng)冷凍(-70℃)處理后冰凍切片，行油紅O染色，用顯微圖像采集系統(tǒng)(Leica DMIRB)觀察并采圖。
　　6.心肌中KLF15 mRNA表達(dá)程度檢測根據(jù)TRIzol試劑(TaKaRa)提取心肌組織中總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄的試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒說明書操作步驟操作，獲得cDNA的產(chǎn)物，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，β-ac

7、tin作為內(nèi)參。RT-PCR檢測反應(yīng)系統(tǒng)根據(jù)TaKaRa公司RNA PCR Kit(AMV)Ver3.0說明步驟操作進(jìn)行。
　　7.Western blot檢測KLF15在心臟中的表達(dá)用Western blot方法檢測KLF15蛋白在心肌中的表達(dá)，ECL發(fā)光劑顯影，Quantity One軟件分析計(jì)算KLF15/GAPDH灰度比值。
　　結(jié)果:1.在非人工通氣下主動(dòng)脈瓣上升主動(dòng)脈縮窄術(shù)中死亡6只大鼠，死亡率為15％;去縮窄術(shù)

8、中死亡4只，死亡率11.8％。卸負(fù)荷當(dāng)天、3、6周組及對(duì)照組各剩余5只，超聲心動(dòng)圖可見大鼠升主動(dòng)脈瓣上縮窄術(shù)后明顯縮窄;而卸負(fù)荷后縮窄處已明顯消失。
　　2.升主動(dòng)脈縮窄9周后行超聲心動(dòng)圖檢查:與對(duì)照組相比，隨著縮窄時(shí)間的延長，心功能(EF、FS)進(jìn)一步降低(P＜0.01);與對(duì)照組相比，心臟卸負(fù)荷組心臟功能明顯降低(P＜0.05）;與心臟超負(fù)荷組9周相比，心臟卸負(fù)荷3周組與心臟卸負(fù)荷6周組心臟功能有所恢復(fù)，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜

9、0.05）。心臟卸負(fù)荷3周組與心臟卸負(fù)荷6周組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.根據(jù)游離脂肪酸試劑盒檢測結(jié)果:與對(duì)照組相比，隨著心臟壓力超負(fù)荷的時(shí)間越長，心肌組織中游離脂肪酸含量進(jìn)一步增多(P＜0.05)，與壓力超負(fù)荷9周組相比，卸負(fù)荷3周、6周組心肌組織中游離脂肪酸含量有所減少，但是仍高于對(duì)照組中游離脂肪酸含量(P＜0.05)。
　　4.油紅O染色可見，與對(duì)照組相比，隨著心臟壓力超負(fù)荷的時(shí)間越長，心肌組織中脂質(zhì)（紅色區(qū)域）沉積

10、進(jìn)一步增多，與壓力超負(fù)荷9周組相比，卸負(fù)荷3周組中心肌脂質(zhì)沉積有所減少，但是仍比對(duì)照組脂質(zhì)沉積更多。
　　5.心臟壓力超負(fù)荷9周、12周、15周組心肌KLF15mRNA表達(dá)顯著低于相應(yīng)對(duì)照組(P＜0.05)，而心臟壓力卸負(fù)荷0周、3周、6周組與心臟壓力超負(fù)荷9周組比較無顯著性差異。
　　6.與對(duì)照組相比，心臟壓力超負(fù)荷組KLF15蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）;與對(duì)照組相比，心臟卸負(fù)荷組KLF15蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.

11、05);與心臟壓力超負(fù)荷9周組相比，心臟卸負(fù)荷3周組及心臟卸負(fù)荷6周組KLF15蛋白表達(dá)無明顯變化。
　　結(jié)論:1.SD大鼠心臟超負(fù)荷后脂質(zhì)沉積增多，卸負(fù)荷后脂質(zhì)沉積有所減少，但是仍高于對(duì)照組。
　　2.SD大鼠升主動(dòng)脈縮窄后KLF15含量降低，隨著縮窄時(shí)間的延長，心肌中KLF15含量進(jìn)一步降低，升主動(dòng)脈去縮窄后KLF15含量變化不明顯，隨著去縮窄的時(shí)間延長，仍處于一個(gè)低表達(dá)的狀態(tài)。
　　3.SD大鼠心臟卸負(fù)荷后，KL