雄激素受體通過抑制miR-145促進(jìn)腎癌細(xì)胞侵襲和增殖的機制研究.pdf

1、第一部分 AR促進(jìn)RCC細(xì)胞增殖和侵襲遷移的功能研究
　　目的：
　　檢測雄激素受體（AR）在腎癌（RCC）中的表達(dá)，構(gòu)建干擾和過表達(dá)AR的RCC細(xì)胞系，通過檢測干擾或過表達(dá)AR的RCC細(xì)胞系增殖和遷移侵襲能力的差異，探討AR對RCC細(xì)胞增殖和遷移侵襲的功能影響。
　　方法：
　　Western blot檢測OSRC-2、HK2、ACHN和SW-839細(xì)胞中AR的表達(dá)情況。并以AR陽性前列腺癌（PCa）細(xì)胞系C4

2、-2和AR陰性PCa細(xì)胞系PC-3作為AR對照，GAPDH作為內(nèi)參。構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)AR（sh-AR）的SW-839的細(xì)胞系及穩(wěn)定高表達(dá)AR（OE AR）的OSRC-2、 ACHN細(xì)胞系。Western blot檢測sh-AR SW-839細(xì)胞中AR的表達(dá)情況以及OE AR的OSRC-2、ACHN細(xì)胞系中AR的表達(dá)情況，以驗證所構(gòu)建細(xì)胞系是否成功。采用Transwell Assay檢測sh-AR的SW-839細(xì)胞和OE AR的OSRC-2

3、、 ACHN細(xì)胞遷移和侵襲的能力。并兩兩比較組間RCC細(xì)胞侵襲能力差異：①sh-AR的SW-839細(xì)胞組對比scr對照組；②OE AR的OSRC-2、ACHN細(xì)胞組對比空載質(zhì)粒對照組（Vec），并做統(tǒng)計學(xué)分析組間差異。利用3D spheroid侵襲試驗進(jìn)一步證實Transwell侵襲實驗的結(jié)果：①sh-AR的SW-839細(xì)胞組對比scr對照組；②OE AR的OSRC-2細(xì)胞組對比Vec對照組，并做統(tǒng)計學(xué)分析組間差異。最后采用MTT增殖實

4、驗在細(xì)胞增殖能力差異的角度論證調(diào)控AR表達(dá)對RCC進(jìn)展的影響：①sh-AR的SW-839細(xì)胞組對比scr對照組；②OE AR的OSRC-2、ACHN細(xì)胞組對比Vec對照組，并做統(tǒng)計學(xué)分析組間差異。
　　結(jié)果：
　　我們首先檢測了AR在各種RCC細(xì)胞系中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)AR在SW-839細(xì)胞系中高表達(dá)，而在OSRC-2、ACHN細(xì)胞系中低表達(dá)。然后我們通過調(diào)節(jié)AR的表達(dá)水平研究AR在RCC進(jìn)展中所扮演的角色。采用Transwe

5、ll Assay檢測細(xì)胞遷移和侵襲的能力，我們發(fā)現(xiàn)與各自相應(yīng)的對照組相比，干擾SW-839細(xì)胞AR的表達(dá)可以抑制細(xì)胞侵襲。而過表達(dá)AR的OSRC-2、ACHN細(xì)胞獲得更強的侵襲能力。通過3D spheroid侵襲實驗我們得到了與Transwell Assay類似的結(jié)果，與各自相應(yīng)的對照組相比，干擾SW-839細(xì)胞AR的表達(dá)可以抑制細(xì)胞侵襲。而過表達(dá)AR的OSRC-2、ACHN細(xì)胞獲得了更強的侵襲能力。我們還用MTT法檢測AR表達(dá)程度對各

6、個細(xì)胞系增殖能力的影響，與各自相應(yīng)的對照組相比，干擾AR的表達(dá)使得SW-839增殖能力明顯下降，而過表達(dá)AR的OSRC-2、ACHN細(xì)胞增殖能明顯上升。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，所有組間差異P<0.05。
　　結(jié)論：
　　首先，sh-AR SW-839的細(xì)胞系及OE AR的OSRC-2、ACHN細(xì)胞系構(gòu)建成功。AR在普通OSRC-2、ACHN細(xì)胞中低表達(dá)，在普通SW-839細(xì)胞中高表達(dá)。AR可以促進(jìn)RCC細(xì)胞的增殖和遷移侵襲。以上結(jié)論為

7、下一步探討AR促進(jìn)RCC增殖和侵襲遷移能力的機制奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分 MiR-145受AR負(fù)性調(diào)節(jié)抑制腎癌細(xì)胞的增殖和侵襲遷移的功能研究
　　目的：
　　研究miR-145在RCC中的表達(dá)水平以及與AR表達(dá)的相關(guān)性。研究miR-145對RCC增殖和侵襲遷移的影響。
　　方法：
　　采用Real-time PCR來檢測AR對下游一系列miRNA差異性表達(dá)的影響。PCR檢測分析驗證AR對miR-145的影

8、響。應(yīng)用Real-time PCR對RCC臨床標(biāo)本的癌組織及癌旁組織中AR和miR-145的表達(dá)情況進(jìn)行檢測并做相關(guān)性分析。通過Transwell assay和MTT assay檢測同時調(diào)控AR和miR-145的表達(dá)對RCC細(xì)胞增殖和遷移侵襲的影響。
　　結(jié)果：
　　我們采用 Real-time PCR發(fā)現(xiàn)人為調(diào)控 AR的表達(dá)水平后，在一系列的miRNA差異變化中miR-145差異性表達(dá)最顯著。同時采用PCR分別在SW-83

9、9和OSRC-2、ACHN細(xì)胞中驗證了干擾AR后miR-145差異性高表達(dá)（P＜0.01）；過表達(dá)AR后miR-145差異性低表達(dá)(P＜0.01)。最后我們檢測20例RCC患者，癌組織與癌旁組織中AR及miR-145的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中AR高表達(dá)而在癌旁組織中miR-145高表達(dá)，相關(guān)性分析提示AR和miR-145表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.453，p=0.045，n=20）。通過Transwell assay和MTT assay我

10、們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-145或過表達(dá)AR可以分別抑制或促進(jìn)RCC細(xì)胞的侵襲和增殖。反之，抑制miR-145或抑制AR后可以分別促進(jìn)或抑制RCC細(xì)胞的侵襲和增殖。
　　結(jié)論：
　　我們通過實驗，多角度論證了在 RCC細(xì)胞中 AR可以抑制 miR-145的表達(dá)。AR的表達(dá)與miR-145的表達(dá)成呈負(fù)相關(guān)。miR-145受AR的負(fù)性調(diào)節(jié)抑制RCC的增殖和侵襲遷移。
　　第三部分 AR-miR-145-HIF2a軸在腎癌中分子機

11、制研究
　　目的：
　　研究AR抑制miR-145的作用機制以及AR抑制的miR-145通路影響RCC進(jìn)展的作用機制。
　　方法：
　　通過染色質(zhì)免疫共沉淀實驗檢測AR是否結(jié)合到miR-145的啟動子區(qū)域。采用western blot檢測AR是否通過p53抑制miR-145的表達(dá)。建立穩(wěn)定低表達(dá)AR（sh-AR）和穩(wěn)定高表達(dá)AR（OE-AR）的RCC細(xì)胞系，通過western blot檢測低表達(dá)AR及高表達(dá)AR時

12、，HIF2α、VEGF、MMP9和CCND1的表達(dá)變化來研究AR與HIF2α、VEGF、MMP9和CCND1的影響關(guān)系。通過western blot檢測轉(zhuǎn)染了miR-145 mimic后，HIF2α、VEGF、MMP9和CCND1的表達(dá)變化，來了解它們之間的影響關(guān)系。通過western blot檢測sh-AR的SW-839細(xì)胞及OE AR的OSRC-2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor及 miR-145 mimic前后HI

13、F2α、VEGF、MMP9和CCND1表達(dá)變化來了解在VHL突變型RCC細(xì)胞系中AR抑制miR-145發(fā)揮促癌作用的機制。在VHL野生型ACHN細(xì)胞中的類似研究，探討AR-VHL通路與AR-miR-145通路的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　AR反應(yīng)元件（ARE）位于miR-145轉(zhuǎn)錄起始區(qū)上游575個堿基處。通過染色質(zhì)免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)AR通過與miR-145啟動子區(qū)域的ARE結(jié)合從而抑制miR-145的表達(dá)。提示AR能在轉(zhuǎn)錄層面

14、調(diào)控miR-145的表達(dá)。通過western blot實驗我們觀察到 sh-AR所誘導(dǎo) miR-145的表達(dá)增加程度可以被抑制 p53表達(dá)（p53-shRNA）減弱，說明p53在AR的上游調(diào)控miR-145的表達(dá)。AR可以通過與miR-145啟動子區(qū)域的ARE直接結(jié)合來抑制p53對miR-145轉(zhuǎn)錄的激活。通過western blot發(fā)現(xiàn)AR可以增加HIF2α、VEGF、MMP9和CCND1的表達(dá)；而miR-145能降低HIF2α、VE

15、GF、MMP9和CCND1的表達(dá)，另外通過轉(zhuǎn)染miR-145 mimic或miR-145 inhibitor可以一定程度上逆轉(zhuǎn)AR對HIF2α、VEGF、MMP9和CCND1表達(dá)的影響，說明在VHL突變型SW-839及OSRC-2細(xì)胞中AR抑制miR-145發(fā)揮促癌作用是通過激活HIF2α/VEGF/MMP9/CCND1信號通路來的實現(xiàn)的。在VHL野生型ACHN細(xì)胞中，miR-145抑制VHL表達(dá)；轉(zhuǎn)染miR-145 mimic可以逆轉(zhuǎn)

16、AR對VHL表達(dá)的促進(jìn)作用及AR對VHL下游通路的激活作用。無論是在VHL突變型還是VHL野生型RCC細(xì)胞中，AR抑制miR-145通路在 RCC進(jìn)展中都扮演重要角色，其作用是通過激活HIF2α/VEGF/MMP9/CCND1信號通路來實現(xiàn)的。
　　結(jié)論：
　　AR通過調(diào)控p53來抑制miR-145啟動子活性。AR通過miR-145調(diào)節(jié)HIF2α的表達(dá)。無論是在VHL野生型還是VHL突變型RCC細(xì)胞中，AR- miR-145

17、-HIF2a軸對于RCC的進(jìn)展都起著至關(guān)重要的作用。
　　第四部分 AR通過抑制miR-145促進(jìn)腎癌生長和轉(zhuǎn)移的體內(nèi)實驗研究
　　目的：
　　通過體內(nèi)實驗證實了AR通過抑制miR-145促進(jìn)RCC進(jìn)展，這種作用是通過誘導(dǎo)HIF2a表達(dá)上調(diào)來實現(xiàn)的。
　　方法：
　　首先構(gòu)建了高表達(dá)AR（OE AR）及高表達(dá)miR-145（OE miR-145）的OSRC-2細(xì)胞細(xì)胞系。通過PCR檢測構(gòu)建好的細(xì)胞系中miR

18、-145的表達(dá)情況。將分組好的OSRC-2細(xì)胞原位異種移植到裸鼠腎包膜下，使用IVIS成像系統(tǒng)（體外成像）監(jiān)測腫瘤進(jìn)展對比腫瘤的大小。處死小鼠，取出腎臟及腫瘤。按照分組對比腫瘤的質(zhì)量，統(tǒng)計學(xué)方法檢驗有無差異。觀察RCC在膈肌及肝門的轉(zhuǎn)移情況，比較各組間 RCC轉(zhuǎn)移發(fā)生的情況及轉(zhuǎn)移灶的多寡。HE染色確認(rèn)轉(zhuǎn)移灶是否為RCC細(xì)胞。免疫組化確認(rèn)AR/ HIF2α/VEGF/ MMP9/CCND1在不同組別的表達(dá)情況是否與第三部分采用wester

19、n blot檢測所得結(jié)果相同。
　　結(jié)果：
　　構(gòu)建并驗證穩(wěn)定高表達(dá)miR-145的OSRC-2細(xì)胞系。PCR驗證效果，兩組之間比較miR-145的表達(dá)水平有顯著差異（P＜0.01），說明細(xì)胞系構(gòu)建成功。5周以后觀察結(jié)果。與對照組Vec-AR相比，過表達(dá)AR的OSRC-2細(xì)胞導(dǎo)致裸鼠體內(nèi)腫瘤生長速度和腫瘤質(zhì)量明顯增加；而穩(wěn)定表達(dá) miR-145的OE-AR OSRC-2細(xì)胞可以部分逆轉(zhuǎn)AR促癌作用，并減少RCC腫瘤生長速度和

20、腫瘤重量。通過IVIS圖像系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，OE-AR組的6只裸鼠中5只發(fā)生轉(zhuǎn)移；對照組有2只發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。而在OE-AR+ OE-miR-145組只有1只老鼠發(fā)生轉(zhuǎn)移；OE-miR-145組沒有老鼠發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。HE染色證實了裸鼠腎臟以及轉(zhuǎn)移灶的腫瘤都是RCC細(xì)胞。免疫組化確認(rèn)AR/HIF2α/VEGF/MMP9/CCND1在不同組別的表達(dá)情況與第三部分采用western blot檢測所得結(jié)果相同。
　　結(jié)論：
　　通過體內(nèi)實驗證實了