HIF-1-ET-1途徑對大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的調(diào)控作用及機制.pdf

1、目的：本研究采用大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，建立了HIF-1α過表達(dá)及低表達(dá)細(xì)胞系，Real-time PCR及Western blot分別檢測HIF-1α、ET-1、ETA,ETB、MLCK、p-MLC、ZO-1的mRNA及蛋白表達(dá)情況，探討HIF-1/ET-1途徑對大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的調(diào)控作用及機制。
　　方法：（1）將大鼠麻醉，取出腹主動脈后放入 D-Hanks液中，去除血管周圍脂肪等組織，把血管翻轉(zhuǎn)，使血管腔面暴露在

2、外，用膠原酶使血管內(nèi)皮細(xì)胞離散下來，待細(xì)胞生長至80％～90％融合時，用胰蛋白酶消化后按1:2傳代，3～5代細(xì)胞用于下一步實驗；（2）將大鼠HIF-1α基因PCR擴增后，與GV230質(zhì)粒載體連接，形成重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109，再提取并鑒定重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，形成 HIF-1α過表達(dá)細(xì)胞系；（3）設(shè)計和合成shRNA，把shRNA與質(zhì)粒GV248連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，提取重組質(zhì)粒

3、并鑒定，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，篩選出有效的重組質(zhì)粒，然后再次轉(zhuǎn)染大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，形成HIF-1α低表達(dá)細(xì)胞系；（4）Real-time PCR檢測兩組細(xì)胞 HIF-1α、ET-1、ETA、ETB、MLCK、 p-MLC、ZO-1相關(guān) mRNA水平;（5）Western blot檢測兩組細(xì)胞的HIF-1α、ET-1、ETA、ETB、MLCK、p-MLC、ZO-1蛋白水平。（6）Real-time PCR結(jié)果分析采用2-△△

4、Ct進(jìn)行分析，統(tǒng)計分析采用GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行；Western blot結(jié)果采用Quantity one灰度分析軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x±s)”表示。
　　結(jié)果：（1）HIF-1α過表達(dá)時HIF-1α、ET-1、ETA、ETB、MLCK、p-MLC的mRNA水平均升高（P＜0.05）；ZO-1 mRNA水平降低（P＜0.05）；（2）HIF-1α過表達(dá)時HIF-1α、ET-1、ETA、ET

5、B、MLCK、p-MLC的蛋白水平均升高（P＜0.05）；ZO-1蛋白水平降低（P＜0.05）（3）HIF-1α低表達(dá)時HIF-1α、ET-1、ETA、ETB、MLCK、p-MLC的mRNA水平均降低（P＜0.05）；ZO-1 mRNA水平升高（P＜0.05）（4） HIF-1α低表達(dá)時HIF-1α、ET-1、ETA、ETB、MLCK、 p-MLC的蛋白水平均降低（P＜0.05）；ZO-1蛋白水平升高。
　　結(jié)論:通過細(xì)胞培養(yǎng)、R