低氧環(huán)境對黑色素瘤細胞的增殖及LDH和Nodal表達的影響.pdf

1、目的:黑色素瘤（malignant melonoma,MM)是目前發(fā)病率上升最快、預后最為不良的惡性腫瘤之一，病死率居高不下。而決定其MM細胞代謝及增殖能力的機制仍不明，但可能與遺傳、創(chuàng)傷、免疫和病毒感染有關(guān)。目前認為局部低氧是實體惡性腫瘤增殖過程中存在的普遍現(xiàn)象，低氧作為潛在信號可引起低氧相關(guān)基因及蛋白產(chǎn)生，使細胞適應低氧微環(huán)境。而高糖酵解是惡性腫瘤細胞的代謝特征之一，干預腫瘤細胞代謝將影響 MM的惡性程度。MM發(fā)生增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的

2、原因和機制是什么？什么是調(diào)控 MM進程的關(guān)鍵點？隨著研究的深入，低氧條件下腫瘤糖酵解途徑的異常激活及Nodal分子促進腫瘤發(fā)生作用受到關(guān)注。本課題擬使用氯化鈷（CoCl2）誘導的MM細胞株A375細胞低氧，構(gòu)建MM細胞低氧模型，以LDH介導的腫瘤細胞增殖作用為切入點，在細胞水平探討 Nodal（ Nodal growth differentiation factor）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）同工

3、酶亞基(LDH-A、LDH-B)蛋白的表達及 LDH同工酶譜變化，結(jié)果可對 MM的靶向治療提供理論依據(jù)。方法：培養(yǎng)MM時加入含不同濃度化學低氧誘導劑 CoCl2的培養(yǎng)液（50、100、150、200、250、300、400uM），作用不同時間（12、24、48、72h），并設立對照組（CoCl2濃度為0uM），然后通過MTT法觀察低氧對MM細胞增殖能力的影響，以確立CoCl2誘導MM細胞增殖的適宜濃度和時間。采用 Western Blo

4、t技術(shù)檢測低氧誘導因子（Hypoxia-inducible factor，HIF-1a）蛋白表達水平以確定造模是否成功。Western Blot技術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測低氧對MM細胞LDH-A、LDH-B、Nodal蛋白的表達及LDH同工酶譜活性的影響。結(jié)果：MTT法顯示CoCl2誘導的低氧對MM細胞的增殖能力隨著CoCl2作用濃度的遞增和作用時間的延長其增殖活性逐漸下降。其中，CoCl2的作用濃度50、100、150、200、25

5、0uM時細胞增殖無明顯抑制（P>0.05）。從300uM開始就表現(xiàn)出明顯抑制作用。當CoCl2的作用濃度為50、100、150uM，細胞在48h增殖達高峰（P<0.05）。Western Blot技術(shù)檢測結(jié)果顯示CoCl2可上調(diào)MMA375細胞 HIF1-a、LDH-A、Nodal蛋白的表達，下調(diào)LDH-B蛋白表達（P<0.05），并呈現(xiàn)出一定的濃度及時間范圍依賴性關(guān)系；瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測結(jié)果顯示隨著缺氧濃度的遞增，LDH同工酶譜變