Wbct白斑小鼠突變基因的鑒定及純合子小鼠胚胎死亡的研究.pdf

1、Pax3是胚胎發(fā)育中生肌前體細胞移行、增殖、分化及神經(jīng)胚層發(fā)育的重要調控因子。人與小鼠Pax3突變均可導致胚胎時期神經(jīng)嵴的發(fā)育異常，從而引起多種異常表型，與瓦爾敦堡綜合征、橫紋肌肉瘤、神經(jīng)管缺陷畸形等疾病有密切聯(lián)系。Wbct小鼠是通過ENU誘變手段獲得的白斑突變小鼠，在先前的研究中，吳寶金等將其突變基因初步定位于小鼠第1號染色體距著絲粒約41.6cM處。本研究在先前初步定位工作的基礎上，確定了Wbct白斑突變表型的遺傳模式，并確定該表型

2、是由Pax3基因無義突變引起的。在成功進行突變基因鑒定的基礎上，建立了Wbct突變小鼠基因型分析方法，對Wbct純合子小鼠胚胎期死亡進行了觀察與分析。本論文的工作由兩部分組成。
　　 1.Wbct小鼠白斑表型突變基因的精確定位及鑒定。
　　 將B6背景的突變雜合子與正常B6小鼠交配，計算G1代小鼠中突變小鼠與正常小鼠數(shù)目，將其與單基因顯性遺傳模式的理論數(shù)值進行卡方檢驗，確定遺傳模式；將B6背景的Wbct突變雜合子與正常D

3、2小鼠雜交獲得F1代突變小鼠(尾部白化)，再將F1突變小鼠回交B6小鼠獲得N2代突變小鼠，提取N2代突變小鼠尾尖DNA；選用位于第1號染色體的微衛(wèi)星引物D1Mit180(距著絲粒41cM)和D1Mit415(距著絲粒52cM)，PCR擴增N2代突變小鼠基因組DNA進行精確定位；PCR分別擴增Wbct雜合子小鼠Pax3基因9個外顯子序列，膠回收后測序；用DNA star軟件對Wbct小鼠Pax3基因序列進行分析，預測堿基變化可能導致的氨基

4、酸改變。
　　 結果表明Wbct小鼠為單基因顯性遺傳，外顯率為100％。在B6背景中，Wbct突變雜合子主要表現(xiàn)為尾部白化，腹部白斑較大，并且白斑大小差異較小。而在與DBA雜交過程中發(fā)現(xiàn)(B6×D2)F1代突變小鼠尾部白化，但白斑明顯減少或消失，[(B6×D2)F1×B6]N2代小鼠尾部白化但腹部白斑大小差異較大，提示D2背景的介入對黑色素細胞發(fā)育障礙有部分代償作用。微衛(wèi)星檢測結果顯示D1Mit180與突變基因重組率為(3.19

5、±2.51)％，D1Mit415與突變基因重組率為(9.04±4.10)％，D1Mit180與D1Mit415重組共為23例，重組率為(12.23±4.68)％，突變基因被定位于據(jù)著絲粒約43.87cM。對附近逐個基因功能分析發(fā)現(xiàn)位于44cM處Pax3基因突變小鼠表型與Wbct極為相似，故確定Pax3基因為Wbct突變的強力候選基因。PCR產(chǎn)物測序結果表明，雜合子小鼠Pax3第二號外顯子的測序峰圖上出現(xiàn)了明顯的重疊波，用DNA star

6、軟件對測序結果進行分析顯示，Wbct雜合子一條染色體上Pax3基因編碼區(qū)第88位密碼子由UGC變?yōu)榻K止密碼子UGA，導致蛋白編碼提前終止，是引起白斑突變表型的原因。
　　 2.Wbct純合子小鼠胚胎死亡的初步研究。
　　 突變雜合子保種繁殖采用將突變雜合子小鼠與B6背景品系回交的方式，突變純合子繁殖采用將突變雜合子互交的方式；將Wbct雜合子小鼠互交，選取孕期10.5d和12.5d的母鼠，取胚胎進行形態(tài)學觀察；提取Wbc

7、t雜合子互交后代小鼠胚胎DNA，由于Wbct突變雜合子小鼠Pax3基因第二號外顯子C變?yōu)锳，引起HpyCH4V酶切位點的消失，我們以該突變位點為目標，在其兩側設計引物PCR擴增目的片段，使用HpyCH4V內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進行酶切，并對酶切結果與單基因顯性遺傳模式的理論數(shù)值進行卡方檢驗，驗證其是否符合自由組合定律。
　　 結果表明Wbct白斑雜合子互交繁殖獲得127只后代，未出現(xiàn)新的表現(xiàn)型或見到擴大的白斑區(qū)域；將其中55只后代與

8、正常B6配種，后代均為毛色正常的子代小鼠，說明后代小鼠中未出現(xiàn)突變純合子小鼠，推測突變基因純合致死。我們在Wbct雜合子小鼠與正常B6小鼠交配的后代中發(fā)現(xiàn)了一種出現(xiàn)彎尾表型的異常小鼠，該小鼠尾巴大多向背部方向卷曲，該表型尚未見其它文獻報道。在表現(xiàn)異常的小鼠胚胎中，我們觀察到異常胚胎羊膜血管明顯減少，顏色蒼白，體型明顯比正常小鼠小，發(fā)育遲緩；有些小鼠胚胎頭部明顯凹陷，為神經(jīng)管缺陷畸形的典型表現(xiàn)。我們對小鼠胚胎酶切鑒定的結果進行了統(tǒng)計，通過