聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1在急性髓系白血病中的作用及機制研究.pdf

1、本課題旨在明確AML患者骨髓標本中PARP-1的表達情況，通過小鼠體內實驗研究其對AML疾病進展的影響，在AML細胞系Kasumi-1和THP-1增殖和凋亡中的作用，以及通過基因芯片篩選并證實PARP-1影響的具體分子通路。本課題研究內容為AML的基礎研究提供新的思路，給臨床診療工作提供更多可參考利用的生物學靶點。
　　第一部分 PARP-1在急性髓系白血病發(fā)生發(fā)展中的作用
　　目的:
　　研究PARP-1分子在成人A

2、ML患者及正常對照者的骨髓標本中的表達水平，分析其與臨床預后的關系;通過構建AML模型小鼠，闡明PARP-1分子對AML疾病進展的影響。初步明確PARP-1分子在AML中的作用，并為后續(xù)深入探討PARP-1在AML中的分子機制打下基礎。
　　方法:
　　1.標本收集:收集成人AML患者及健康對照者的骨髓標本并分離出骨髓單個核細胞凍存。
　　2.實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(real-time RT-PCR)法檢測P

3、ARP-1的表達水平:采用TRIzol法提取骨髓單個核細胞總RNA，應用PrimeScript RTreagent試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，SYBR Green法檢測AML患者及健康對照者的骨髓單個核細胞中PARP-1表達情況，分析其與臨床療效的關系。
　　3.AML模型小鼠的構建:從ATCC購買小鼠AML細胞系C1498,體外培養(yǎng)擴增，然后尾靜脈注射至C57BL/6小鼠體內。通過外周血涂片、骨髓涂片及組織切片染色鑒定模型。

4、
　　結果:
　　1.Real-time RT-PCR結果顯示，PARP-1在AML患者骨髓標本中的表達水平顯著高于健康對照者，不同分型之間沒有顯著統(tǒng)計學差異。PARP-1表達水平較高的患者治療效果差。
　　2.C1498細胞尾靜脈注射C57BL/6小鼠成功構建小鼠AML模型。
　　發(fā)病小鼠消瘦明顯，毛發(fā)粗糙，活動減少，體重減輕;一部分模型小鼠外周血白細胞顯著增高，另一部分明顯降低，血小板均減少，血涂片及骨髓涂片

5、可見腫瘤細胞浸潤;肝臟腫大明顯，部分臟器腫瘤浸潤形成腫塊;組織切片H&E染色可見肝、脾及腎臟內大量的腫瘤細胞;未經(jīng)干預的模型小鼠于一月之內因疾病進展而死亡。
　　3.抑制PARP-1的作用能夠顯著緩解AML小鼠疾病進展。
　　3.1 與對照組小鼠相比，實驗組小鼠消瘦減輕，毛發(fā)粗糙不明顯，活動較正常，體重減輕情況也明顯改善。
　　3.2 實驗組小鼠肝脾腫大程度較對照組減輕。
　　3.3 流式細胞術證實外周血及肝臟中

6、C1498-GFP細胞的含量在實驗組中均明顯降低。
　　3.4 組織切片H&E染色結果顯示，實驗組小鼠的肝臟中C1498-GFP細胞浸潤程度減輕。
　　3.5 實驗組小鼠中位生存時間較對照組延長，兩者分別為37.5天和23.5天。
　　結論:
　　1.PARP-1分子在AML患者骨髓標本中高表達，相對表達水平較高的患者治療效果差，提示PARP-1可能參與AML的發(fā)生發(fā)展過程，并且在預后指導方面具有一定意義。

7、>　　2.通過動物模型初步證實，抑制PARP-1的活性，明顯減輕腫瘤細胞的體內浸潤程度，延緩AML的疾病進展過程，改善預后，因此干預PARP-1的活性有可能成為AML靶向治療策略之一。
　　第二部分 PARP-1對AML細胞生物學行為的影響及作用機制研究
　　目的:
　　研究PARP-1抑制對AML細胞系生物學行為及相關分子通路的影響;篩選并驗證PARP-1抑制導致顯著上調或下調表達的分子，分析PARP-1調節(jié)顯著的基

8、因功能和分子通路;明確下游分子在AML患者骨髓標本中的表達，與臨床預后的關系，及對AML細胞存活及下游分子通路的影響;進一步分析驗證PARP-1與下游分子的相互影響。深入探討PARP-1參與AML發(fā)生發(fā)展的具體分子機制，為AML靶向治療提供新的理論基礎。
　　方法:
　　1.PARP-1抑制對AML細胞系Kasumi-1和THP-1細胞活力、周期、凋亡及相關分子通路的影響。
　　1.1 CCK8法檢測細胞活力:配制不同

9、濃度梯度的PJ34溶液，分別加入Kasumi-1和THP-1細胞培養(yǎng)基中，孵育48小時，CCK8法檢測并計算細胞存活率及IC50值;用分別攜帶PARP-1干擾序列及對照序列的慢病毒感染兩種AML細胞系，驗證干擾效率后進行常規(guī)培養(yǎng)，CCK8法檢測24h、48h及72h的細胞活力，對比生長曲線。
　　1.2 流式細胞術檢測細胞周期:收集PJ34處理48h后的兩種細胞，碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色，利用流式細胞

10、儀檢測細胞周期的變化。
　　1.3 流式細胞術檢測細胞凋亡:PJ34處理細胞48h，AnnexinⅤ FITC/PI雙染細胞，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
　　1.4 Western blot檢測周期蛋白、凋亡分子及下游通路分子的表達情況:收集處理后的細胞，提取細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，SDS-PAGE膠進行凝膠電泳，western blot方法檢測PARP-1抑制對細胞周期蛋白cyclin B1、CDK1、P

11、27和細胞凋亡相關分子Bcl-2、Bcl-xL以及AKT、ERK1/2通路的影響。
　　2.篩選PARP-1下游分子及通路:應用表達譜芯片技術篩選PARP-1抑制后顯著差異表達的分子，并初步驗證芯片結果。利用GO富集分析法和KEGG通路分析法分析受PARP-1影響顯著的基因功能和分子通路。
　　3.研究PARP-1下游分子MPL在AML中的作用。
　　3.1 Real-time RT-PCR法:檢測上述收集的AML患者

12、及健康對照者的骨髓標本中MPL的表達水平，并分析其與臨床療效的關系。
　　3.2 病毒感染:構建MPL過表達及干擾病毒，分別感染Kasumi-1和THP-1細胞，western blot驗證過表達及干擾效率。
　　3.3 CCK8實驗:正常培養(yǎng)過表達及干擾MPL分子的兩種AML細胞，CCK8法檢測細胞24h、48h及72h的細胞活力，繪制生長曲線。
　　3.4 Western blot實驗:檢測干擾MPL分子對AML細

13、胞內AKT、ERK1/2、JNK及P38MAPK通路的影響。
　　結果:
　　1.PARP-1對AML細胞活力、周期、凋亡及相關分子通路的影響。
　　1.1 PARP-1干擾抑制AML細胞活力:不同濃度梯度5、10、20、30和40μM的PJ34均能顯著抑制Kasumi-1和THP-1細胞的增殖，導致部分細胞死亡，且具有劑量依賴性。P J34對兩種細胞的IC50值分別為23.5±3.9μM和35.6±5.5μM。利用慢

14、病毒干擾PARP-1的表達，也顯著抑制Kasumi-1和THP-1細胞的生長。
　　1.2 抑制PARP-1使細胞停滯在G2/M期:流式細胞術檢測結果顯示，PJ34處理細胞后，處于G0/G1和S期的細胞減少，而處于G2/M期的細胞顯著增多。Westernblot檢測周期蛋白顯示，PARP-1抑制下調cyclin B1和CDK1的表達水平，上調P27蛋白表達，從而使更多的細胞進入G2/M期。
　　1.3 干擾PARP-1的作用

15、增加AML細胞凋亡:PJ34處理細胞后，細胞凋亡率顯著增加，且P J34濃度越高凋亡細胞越多。Western blot檢測顯示，PJ34導致抗凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-xL表達水平明顯降低。
　　2.表達譜芯片結果及分析:篩選出PARP-1抑制后顯著上調（＞2倍）表達的分子18個，和顯著下調（≤0.5倍）表達的分子9個。初步選取AML相關分子進行real-time RT-PCR實驗，驗證芯片結果可靠。GO富集分析提示PARP-1

16、顯著影響細胞增殖、細胞凋亡、細胞周期、細胞分化、黏附作用、細胞遷移、血管生成、免疫應答及轉錄調節(jié)等多種生理病理過程。KEGG通路分析提示PARP-1參與TCR信號通路、MAPK信號通路、Toll樣受體信號通路、NF-KB信號通路以及JAK/STAT信號通路等多種通路的調節(jié)。
　　3.PARP-1下游分子MPL在AML中的作用。
　　3.1 MPL在AML患者中高表達，相對表達水平較高的患者治療效果差。
　　3.2 MP

17、L促進AML細胞增殖:慢病毒過表達和干擾兩種AML細胞中MPL的表達，蛋白水平證實了慢病毒過表達及干擾效率。培養(yǎng)感染后的細胞，CCK8實驗檢測顯示MPL過表達組細胞增殖明顯高于對照組，而MPL干擾組的增殖顯著低于對照干擾組。
　　3.3 MPL影響AKT和ERK1/2通路:干擾MPL表達后，細胞中p-AKT/t-AKT和p-ERK/t-ERK水平降低，而p-JNK/t-JNK和p-P38/t-P38水平?jīng)]有明顯改變，說明MPL干擾

18、后抑制了AKT及ERK1/2通路的活化，而對JNK及P38通路無顯著影響。
　　結論:
　　1.干擾PARP-1的作用能夠抑制AML細胞的增殖活力、阻礙細胞周期進展、誘導細胞凋亡，與抑制AKT和ERK1/2通路的活化有關。
　　2.PARP-1的下游分子MPL在AML患者中高表達，與不良預后相關;MPL能夠促進AML細胞增殖，激活AKT和ERK1/2信號通路。
　　3.PARP-1能影響MPL的表達，且干預MPL