基于液滴懸掛方法的體外三維胰島微組織構(gòu)建研究.pdf

1、背景：
　　糖尿病是世界上主要的慢性疾病之一，給人類健康帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。而糖尿病主要的發(fā)病機(jī)制之一是胰島功能障礙，所以有關(guān)胰島的糖尿病研究已成為世界各醫(yī)學(xué)研究院的一個(gè)熱點(diǎn)問題。目前，研究糖尿病的常規(guī)體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ绞菃螌蛹?xì)胞培養(yǎng)，但它不能再現(xiàn)體內(nèi)的三維組織結(jié)構(gòu)。隨著微-納米技術(shù)的發(fā)展，利用一些組織工程的方法構(gòu)建的體外三維胰島模型可更好地模擬體內(nèi)胰腺的胰島。體外三維胰島模型可比傳統(tǒng)的單層細(xì)胞培養(yǎng)具有更佳的細(xì)胞功能，在生理或病理?xiàng)l件下都

2、能夠作為實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，更好的觀察胰島行為，在研究糖尿病的分子機(jī)制和臨床胰島移植等方面具有潛在的應(yīng)用前景。近年來，多項(xiàng)研究利用組織工程方法探索構(gòu)建體外三維胰島模型，但采用液滴懸掛法構(gòu)建體外三維胰島模型并將其與二維單層細(xì)胞和原代胰島進(jìn)行形態(tài)與功能方面對(duì)比的研究較少。本課題將利用液滴懸掛法構(gòu)建體外三維β細(xì)胞球微組織作為體外三維胰島模型，對(duì)這一問題進(jìn)行探討。
　　目的：
　　1.采用液滴懸掛法探索構(gòu)建適宜大小體外三維胰島微組織。

3、　　2.從形態(tài)和功能兩個(gè)方面對(duì)所構(gòu)建的體外三維胰島微組織和二維β細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比。
　　3.從形態(tài)和功能兩個(gè)方面對(duì)所構(gòu)建的體外三維胰島微組織和原代胰島進(jìn)行對(duì)比。
　　方法：
　　1.制備液滴懸掛板，培養(yǎng)β細(xì)胞，根據(jù)不同條件，探索制備適宜形態(tài)大小的體外三維胰島微組織的條件，成功制備后，運(yùn)用細(xì)胞活性鑒定試劑盒鑒定其活性。
　　2.采用倒置顯微鏡和免疫熒光技術(shù)觀察體外三維胰島微組織和二維β細(xì)胞形態(tài)上的異同，采用葡萄糖刺激胰

4、島素釋放實(shí)驗(yàn)觀察體外三維胰島微組織和二維β細(xì)胞功能上的異同。
　　3.提取大鼠原代胰島，建立原代胰島模型，采用倒置顯微鏡、免疫熒光技術(shù)和電鏡技術(shù)觀察體外三維胰島微組織和原代胰島形態(tài)上的異同，采用葡萄糖刺激胰島素釋放實(shí)驗(yàn)觀察體外三維胰島微組織和原代胰島功能上的異同。
　　結(jié)果：
　　1.采用液滴懸掛法構(gòu)建適宜形態(tài)大小體外三維胰島微組織的條件是用密度105個(gè)/mlβ細(xì)胞液滴30μl鋪展為直徑5 mm的懸滴。
　　2.

5、體外三維胰島微組織培養(yǎng)7天后，絕大部分細(xì)胞活性良好。
　　3.體外三維胰島微組織與二維β細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上相比，體外三維胰島微組織中β細(xì)胞聚集成球形、橢球形或不規(guī)則形的立體結(jié)構(gòu),直徑大小約100-200μm，細(xì)胞與細(xì)胞之間排列緊密；免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，體外三維胰島微組織表達(dá)豐富的胰島素。
　　4.在功能上進(jìn)行對(duì)比，體外三維胰島微組織胰島素釋放指數(shù)（2.08±0.14）高于二維β細(xì)胞胰島素釋放指數(shù)（1.49±0.21）（P<0.05

6、）。
　　5.體外三維胰島微組織和原代胰島在形態(tài)學(xué)上進(jìn)行對(duì)比，原代胰島呈球形、橢球形或不規(guī)則形立體結(jié)構(gòu),直徑大小約100-200μm，細(xì)胞與細(xì)胞之間排列緊密，原代胰島外表面光滑，有一層膜包裹；體外三維胰島微組織形態(tài)大小和原代胰島類似，但沒有包膜包裹，細(xì)胞裸露在表面。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，體外三維胰島微組織的β細(xì)胞分布和胰島素的表達(dá)量與原代胰島類似。
　　6.在功能上進(jìn)行對(duì)比，三維胰島微組織胰島素釋放指數(shù)（2.08±0.14）低于

7、原代胰島胰島素釋放指數(shù)（2.72±0.31）（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.通過探索實(shí)驗(yàn)條件，采用液滴懸掛法可以構(gòu)建適宜形態(tài)大小且活性良好的體外三維胰島微組織。
　　2.體外三維胰島微組織與二維β細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上相比，體外三維胰島微組織為立體結(jié)構(gòu)；功能上相比，體外三維胰島微組織的胰島素分泌功能優(yōu)于二維β細(xì)胞。
　　3.體外三維胰島微組織與原代胰島在形態(tài)學(xué)上相比，體外三維胰島微組織與原代胰島類似；功能上相比，