攜帶TAT-Apoptin重組減毒鼠傷寒沙門菌的構(gòu)建及其對腫瘤細胞的作用研究.pdf

1、雞貧血病毒(chicken anemia virus, CAV)的功能蛋白VP3可單獨激發(fā)細胞凋亡過程。因此，也被稱為凋亡素(Apoptin)。研究表明，凋亡素能選擇性誘導(dǎo)人肺癌細胞、黑色素癌細胞、乳腺癌細胞等多種腫瘤細胞凋亡，并且對正常二倍體體細胞無作用，被認為是第一個真正意義上可選擇性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡而不損傷正常細胞的凋亡蛋白。然而，天然狀態(tài)下的 Apoptin很難透過細胞膜屏障誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，HIV-1的反式激活因子TAT具有跨

2、膜功能，能高效快速地跨膜轉(zhuǎn)運與之融合表達的蛋白并使之進入細胞，對細胞無損傷；此外，減毒鼠傷寒沙門菌可作為腫瘤基因治療的載體，能夠選擇性聚集在腫瘤組織，并且安全、可靠。
　　因此，本研究利用減毒鼠傷寒沙門菌載體平衡系統(tǒng)構(gòu)建能穩(wěn)定攜帶TAT-Apoptin基因的重組菌株?crp?asdSL1344(pYA3493-TAT-Apoptin)，感染小鼠黑色素瘤細胞B16F10和小鼠肺癌細胞LL/2后觀察分析其抗腫瘤作用，不僅可望為鼠傷寒沙

3、門菌攜帶 Apoptin的體內(nèi)抗腫瘤機制提供一定的理論基礎(chǔ)，更重要的是可為Apoptin在腫瘤治療與應(yīng)用提供新的思路與途徑。主要研究內(nèi)容包括：
　　1.改良型TAT-Apoptin基因的克隆與鑒定
　　以 CAV全基因組為模板，利用 Apoptin引物先擴增出378bp左右的目的片段，連接至pMD19-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑取單菌落，擴大培養(yǎng)后提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I對重組載體pMD19-T-A

4、poptin進行雙酶切鑒定，電泳可見3000bp左右的載體條帶和約為378bp大小的Apoptin目的條帶；再以構(gòu)建好的 pMD19-T-Apoptin為模板，利用 TAT-Apoptin引物成功擴增出411bp左右的TAT-Apoptin融合基因片段，并成功構(gòu)建了重組載體pMD19-T-TAT-Apoptin。對克隆片段進行序列測定及分析后，結(jié)果顯示重組載體pMD19-T-TAT-Apoptin包含完整的Apoptin基因及TAT序列

5、，其中Apoptin基因序列與GenBank（AF199501）中發(fā)表的雞貧血病毒CAV基因序列相比同源性為99.7％。但氨基酸序列同源性為100%。
　　2.攜帶 TAT-Apoptin重組減毒鼠傷寒沙門菌?crp?asdSL1344(pYA3493-TAT-Apoptin)的構(gòu)建及其生物學(xué)特性
　　為構(gòu)建能穩(wěn)定攜帶TAT-Apoptin的重組減毒鼠傷寒沙門菌，分別用EcoR I和Sal I對pMD19-T-TAT-Apo

6、ptin和pYA3493進行雙酶切，將所得目的片段進行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌χ6097，挑取單菌落進行PCR和酶切鑒定，并測序；然后將鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒 pYA3493-TAT-Apoptin電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門菌?crp?asdSL1344，并對該重組減毒沙門菌生長特性、遺傳穩(wěn)定性和表達特性進行分析。PCR和測序表明，成功構(gòu)建重組載體pYA3493-TAT-Apoptin，進一步對重組減毒鼠傷寒沙門菌?crp?asdSL1344(

7、pYA3493-TAT-Apoptin)研究發(fā)現(xiàn)，其生長速度與強毒株 SL1344相比明顯減慢，與缺失株?crp?asdSL1344及互補菌株?crp?asdSL1344(pYA3493)基本一致，且能夠穩(wěn)定遺傳TAT-Apoptin基因，重組菌培養(yǎng)上清經(jīng)SDS-PAGE能檢測到TAT-Apoptin蛋白條帶。以上結(jié)果證明，能穩(wěn)定攜帶 TAT-Apoptin的重組減毒鼠傷寒沙門菌?crp?asdSL1344(pYA3493-TAT-Ap

8、optin)構(gòu)建成功，且該重組菌能分泌性表達TAT-Apoptin蛋白，進一步為減毒鼠傷寒沙門菌攜帶Apoptin的抗腫瘤作用研究奠定一定的基礎(chǔ)。
　　3.重組減毒沙門菌?crp?asdSL1344(pYA3493-TAT-Apoptin)對腫瘤細胞的作用
　　將構(gòu)建好的能穩(wěn)定攜帶 TAT-Apoptin的重組減毒沙門菌?crp?asdSL1344(pYA3493-TAT-Apoptin)體外感染黑色素瘤細胞B16F10和肺

9、癌細胞LL/2，利用Western-blot檢測TAT-Apoptin在不同腫瘤細胞內(nèi)的表達情況，CCK-8法檢測不同MOI及感染時間條件下細胞增殖情況，流式細胞儀和TUNEL法檢測細胞凋亡情況，并進一步分析Caspase-1,3,6,8,9和細胞色素C等信號蛋白的表達情況。Western-blot結(jié)果顯示，重組菌感染B16F10和LL/2細胞后，可在細胞內(nèi)檢測到約20KD的TAT-Apoptin蛋白條帶；CCK-8法實驗結(jié)果表明，MO

10、I濃度越大，抑制率越高，并且隨著感染時間的增加，抑制率逐漸下降，說明重組減毒鼠傷寒沙門菌抑制B16F10和LL/2細胞增殖具有濃度依賴性和時間依賴性；重組減毒鼠傷寒沙門菌感染B16F10、LL/2細胞24h后，熒光顯微鏡下可觀察到TUNEL陽性細胞；AnnexinV/PI流式細胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組減毒鼠傷寒沙門菌感染B16F10細胞后，12h時AnnexinV+/PI+陽性率為18.3%，24h時為23.2%，感染LL/2細胞后12h，A

11、nnexinV+/PI+陽性率可達到52.2%，24h時為39.0%，均明顯高于對照組細胞，這表明重組減毒鼠傷寒沙門菌能夠誘導(dǎo)B16F10和LL/2細胞凋亡；進一步對凋亡信號蛋白分析發(fā)現(xiàn)，重組菌感染腫瘤細胞 B16F10和 LL/2后，能誘導(dǎo)Caspase-3，Caspase-6，Caspase-8，Caspase-9和細胞色素C的表達，互補菌對照組和細胞培養(yǎng)空白組均不能誘導(dǎo)上述信號蛋白的表達，此外Caspase-1在LL/2細胞中表達