炎癥微環(huán)境響應(yīng)性納米藥物抑制血管內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:冠狀動(dòng)脈疾?。–oronary artery disease，CAD）是導(dǎo)致人類(lèi)疾病性死亡的主要原因，僅在2013年就導(dǎo)致全球約814萬(wàn)人死亡。在大多數(shù)情況下，動(dòng)脈粥樣硬化作為一種慢性血管炎癥是導(dǎo)致心血管疾病的最主要的病因。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入手術(shù)（Percutaneous coronary intervention，PCI）包括球囊擴(kuò)張血管成形術(shù)，斑塊旋切術(shù)及支架植入術(shù)等，是治療CAD（急性心肌梗死和急性冠脈綜合征等）常用的非外科手

2、術(shù)治療方式。PCI術(shù)中對(duì)內(nèi)皮的機(jī)械損傷導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷局部血栓形成及血管新生內(nèi)膜過(guò)度增生，進(jìn)而發(fā)生血管再狹窄，是導(dǎo)致手術(shù)失敗需要二次 PCI的主要病因。PCI術(shù)后局部血管炎癥反應(yīng)在血管再狹窄的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起了關(guān)鍵作用，PCI術(shù)中對(duì)內(nèi)皮的損傷或者剝脫，使血小板迅速聚集在受損局部，除了導(dǎo)致血栓形成以外，血小板激活后通過(guò)血小板表面受體募集血液循環(huán)中的白細(xì)胞，隨即白細(xì)胞、激活的血小板及炎性?xún)?nèi)皮釋放包括腫瘤因子壞死-α（Tumor necros

3、is factor-α，TNF-α），血小板源生長(zhǎng)因子（Platelet-derived growth factor，PDGF），堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF），白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）等一系列促炎癥因子，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成，最終形成新生內(nèi)

4、膜，導(dǎo)致血管再狹窄的發(fā)生。
　　針對(duì)血管再狹窄的病理生理特性，目前已研發(fā)出多種藥物，包括抗凝藥物、抗炎藥物、抗細(xì)胞增殖藥物和抗血小板藥物。其中很多藥物屬于系統(tǒng)性給藥，血管內(nèi)皮損傷局部藥物濃度較低，為了提高藥物在損傷部位的濃度往往需要提高給藥劑量，導(dǎo)致藥物副作用的發(fā)生，比如抗血小板及抗凝藥物導(dǎo)致的出血不良反應(yīng)等。藥物洗脫支架雖然明顯降低了血管再狹窄發(fā)生率，但是支架涂層藥物因其沒(méi)有選擇性往往會(huì)導(dǎo)致再內(nèi)皮化延遲，需要長(zhǎng)期雙抗血小板治療（

5、Double anti-platelet therapy，DAPT），另外支架作為一種異物長(zhǎng)期存也會(huì)刺激血管產(chǎn)生局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致有約5-10％的病人仍會(huì)發(fā)生血管再狹窄。
　　最近大量研究表明，納米醫(yī)學(xué)在炎癥相關(guān)疾病包括心血管疾病的診斷和治療上取得了一些極具應(yīng)用前景的進(jìn)展。血管內(nèi)皮損傷局部存在著過(guò)量的活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS），在PCI術(shù)后血管再狹窄的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。另一方面，血

6、管內(nèi)皮損傷局部的炎癥反應(yīng)存在著微酸性環(huán)境。針對(duì)上述問(wèn)題，本研究設(shè)想構(gòu)建炎癥微環(huán)境響應(yīng)性納米藥物來(lái)預(yù)防血管再狹窄的發(fā)生。為此，我們基于β-環(huán)糊精（β-cyclodextrin，β-CD）設(shè)計(jì)合成酸響應(yīng)性載體材料（Ac-bCD）和ROS響應(yīng)性載體材料（Ox-bCD），以抗VSMCs增殖的藥物RAP作為包載藥物，制備相應(yīng)載藥納米粒，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其預(yù)防血管內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生的效果。
　　內(nèi)容:
　　1．炎癥微環(huán)境響應(yīng)性β-CD

7、材料的合成
　　1.1 酸響應(yīng)性材料縮醛化β-CD（Ac-bCD）的合成
　　1gβ-CD和160mg吡啶對(duì)甲苯磺酸鹽（PTS）加入至8 mL無(wú)水二甲基亞砜（DMSO）中，磁力攪拌下充分溶解后，加入4.5 mL的催化劑2-乙氧基丙烯（EP）。3 h后，加入三乙胺終止反應(yīng)。產(chǎn)物加入去離子水徹底洗滌沉淀離心后凍干即得。
　　1.2 ROS響應(yīng)性環(huán)糊精材料（Ox-bCD）的合成
　　2g4-羥甲基苯硼酸頻哪醇酯（PBA

8、P）溶解在12mL無(wú)水二氯甲烷中，加入2.8g1,1’-羰基二咪唑（CDI）室溫活化PBAP。室溫反應(yīng)30min后，加入14mL的二氯甲烷，去離子水徹底清洗三次。收集的有機(jī)相用飽和氯化鈉溶液清洗三遍，無(wú)水硫酸鈉干燥1h即獲得CDI活化的PBAP。之后，1.5g CDI活化的PBAP與250mgβ-CD溶解在20mL無(wú)水DMSO中，將0.8g的4-二甲基吡啶（DMAP）加入至上述溶液中，室溫條件下磁力攪拌12h。最終產(chǎn)品用去離子水沉淀離心

9、后徹底洗滌三次凍干獲取。
　　材料經(jīng)傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜（FT-IR）和1H核磁共振譜（NMR）進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析及驗(yàn)證。
　　2．載雷帕霉素納米粒的制備
　　采用改進(jìn)的納米沉淀-自組裝法制備載雷帕霉素（RAP）納米粒。具體過(guò)程為，精確稱(chēng)取50mg Ac-bCD或者PLGA材料和10mg RAP溶解在2mL乙腈（Ox-bCD載體材料用甲醇作為有機(jī)溶劑溶解）中得到油相，卵磷脂乙醇溶液（4mg，0.4mL）和DSPE-PEG200

10、0（6mg）溶解在9.6mL的去離子水中得到水相。水相在65℃油浴條件下加熱0.5h后，將油相以1mL/min的速度逐滴加入至水相中。室溫條件下攪拌反應(yīng)2h揮發(fā)有機(jī)溶劑，以16000rpm的速度離心并使用去離子水洗三次分別獲得載雷帕霉素PLGA（RAP/PLGA），Ac-bCD（RAP/Ac-bCD）及Ox-bCD（RAP/Ox-bCD）納米粒。Cy5或Cy7.5標(biāo)記的相應(yīng)納米粒由同樣的方法制備。
　　3．納米粒的理化性質(zhì)表征

11、r>　　納米粒的粒徑分布、大小及Zeta電位由馬爾文粒徑儀測(cè)定。將制備的納米粒溶液滴至銅網(wǎng)膜上，室溫?fù)]干后表面形態(tài)由透射電子顯微鏡（TEM）觀(guān)察并采集圖像。載RAP納米粒由乙腈/甲醇混合溶液溶解破乳后，載藥量由高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定。Cy5或Cy7.5含量由熒光光譜儀測(cè)定。
　　4．空白納米粒體外水解實(shí)驗(yàn)
　　空白Ac-bCD納米粒分別分散于pH5.0或7.4的PBS緩沖液中?？瞻譕x-bCD納米粒分散于濃度梯度的H

12、2O2/PBS緩沖液中。于不同時(shí)間點(diǎn)采集樣品采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量500nm處的透光率?？瞻譖LGA納米粒作為非響應(yīng)性載體材料對(duì)照以同樣的方法測(cè)定相應(yīng)透光率。以透光率數(shù)據(jù)計(jì)算相應(yīng)納米粒水解的程度。
　　5．載雷帕霉素納米粒的體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)
　　RAP/Ac-bCD納米粒分別分散于8mL pH值5.0或7.4的PBS緩沖液中，RAP/Ox-bCD納米粒則分散于8mL含或不含1mM H2O2的PBS緩沖液中。于不同時(shí)間點(diǎn)

13、采集樣品并補(bǔ)充相應(yīng)量溶液，HPLC測(cè)定藥物濃度，繪制不同納米粒藥物釋放曲線(xiàn)。同樣的方法以RAP/PLGA納米粒作非響應(yīng)性載體材料對(duì)照繪制相應(yīng)藥物累計(jì)釋放曲線(xiàn)。
　　6．納米粒的細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)
　　SD大鼠（180-200g）安樂(lè)死后取胸主動(dòng)脈，大鼠原代血管平滑肌細(xì)胞（rVSMCs）由組織塊貼壁法分離并培養(yǎng)。第3-6代的rVSMCs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。rVSMCs以3×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中。孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入不同濃度

14、梯度的Cy5標(biāo)記納米粒與細(xì)胞共孵育，另取同一濃度的納米粒與細(xì)胞孵育不同時(shí)間，溶酶體熒光標(biāo)志物（lyso-tracker green）染色標(biāo)記晚期核內(nèi)體/溶酶體，DAPI染核，激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀(guān)察采集圖像。另采用流式細(xì)胞術(shù)（FACS）進(jìn)一步定量分析細(xì)胞吞噬納米粒量。
　　7．載雷帕霉素納米?？箁VSMCs遷移的作用研究
　　采用Transwell小室檢測(cè)RAP不同制劑對(duì)血小板源性生長(zhǎng)因子BB（PDGF-BB）誘導(dǎo)的

15、rVSMCs遷移的影響。rVSMCs以2×105個(gè)/孔的密度接種于12孔板。孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24h后改為含有0.5%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入PDGF-BB（20ng/mL）及RAP終濃度為1μM的不同RAP制劑（RAP原料藥，RAP/PLGA NP，RAP/Ac-bCD NP，RAP/Ox-bCD NP）。6h后胰酶消化收集細(xì)胞加至Transwell小室上層，下層加入PDGF-BB（20ng/mL），分別設(shè)置陰性及陽(yáng)性對(duì)

16、照。孵箱靜置8h待上室細(xì)胞往下室遷移，棉簽輕輕擦去上室細(xì)胞，遷移至Transwell小室下層的細(xì)胞用0.3%結(jié)晶紫染色。光學(xué)顯微鏡高倍條件拍照計(jì)數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。
　　8．載雷帕霉素納米?？箁VSMCs增殖的作用研究
　　rVSMCs以5000個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24h后改為含有0.5% FBS的DMEM培養(yǎng)基，加入PDGF-BB（20ng/mL）及RAP終濃度為1μM的不同RAP制劑（RAP原料藥

17、，RAP/PLGA NP，RAP/Ac-bCD NP，RAP/Ox-bCD NP），分別設(shè)置陰性及陽(yáng)性對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的活力。
　　9．空白納米粒的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究
　　rVSMCs以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，24h后加入濃度梯度的空白納米粒（PLGA NP，Ac-bCD NP，Ox-bCD NP），繼續(xù)培養(yǎng)24h后CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的生存能力。
　　10．載體材料空白納米

18、粒的體內(nèi)急性毒性評(píng)價(jià)
　　雄性SD大鼠（180-200g）隨機(jī)分成4組（n=3）。大鼠采用尾靜脈注射的方式分別注射500mg/kg的PLGA NP、Ac-bCD NP或Ox-bCD NP，對(duì)照組大鼠尾靜脈注射生理鹽水，監(jiān)測(cè)大鼠體重及其活動(dòng)行為。于給藥后第14d對(duì)大鼠實(shí)施安樂(lè)死，收集血液樣本進(jìn)行血液指標(biāo)分析，主要器官稱(chēng)重計(jì)算臟器指數(shù)并行蘇木精-易紅（H&E）染色觀(guān)察其病理變化。另體外溶血試驗(yàn)檢測(cè)納米粒的安全性，采集大鼠血液制備2%紅

19、細(xì)胞懸液，與不同濃度梯度的PLGA NP、Ac-bCD NP或Ox-bCD NP共孵育2h后，離心測(cè)上清中血紅蛋白濃度。
　　11．大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型的建立及損傷部位ROS水平的檢測(cè)
　　雄性SD大鼠麻醉后，脫毛膏去除頸部毛發(fā)，頸部消毒后正中切口暴露頸總、頸內(nèi)及頸外動(dòng)脈，Edwards2F取栓導(dǎo)管球囊經(jīng)由頸外動(dòng)脈切口插入頸總動(dòng)脈，充盈球囊至適當(dāng)阻力，旋轉(zhuǎn)拖拉球囊三次徹底去除頸總動(dòng)脈血管內(nèi)皮，尾靜脈注射伊文思藍(lán)溶液檢測(cè)內(nèi)皮

20、損傷情況，模型建立后14d后取材切片HE染色觀(guān)察內(nèi)膜增生情況。成功建立大鼠頸動(dòng)脈損傷模型之后，取材行DHE染色檢測(cè)局部超氧陰離子表達(dá)水平，并通過(guò)試劑盒檢測(cè)損傷局部過(guò)氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）水平。
　　12．納米粒靶向于血管內(nèi)皮損傷部位的研究
　　大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后，經(jīng)尾靜脈即刻分別注射Cy7.5標(biāo)記的三種熒光納米粒（Cy7.5/PLGA NP，Cy7.5/Ac-bCD NP，Cy7.5/Ox-bCD NP），體

21、內(nèi)循環(huán)8h后，取損傷段頸動(dòng)脈及主要臟器行小動(dòng)物熒光成像（IVIS）觀(guān)察其在血管內(nèi)皮損傷部位靶向情況及組織分布。另外，頸動(dòng)脈球囊損傷后，經(jīng)尾靜脈注射Cy7.5/Ac-bCD納米粒于不同時(shí)間點(diǎn)取損傷段頸動(dòng)脈成像觀(guān)察分析靶向情況和滯留時(shí)間。
　　13．載雷帕霉素納米粒抑制大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷后新生內(nèi)膜形成的研究
　　雄性SD大鼠隨機(jī)分成六組（n=5）：假手術(shù)組，生理鹽水治療組，RAP原料藥組，RAP/PLGA納米粒組，RAP/Ac-

22、bCD納米粒組，RAP/Ox-bCD納米粒組。頸動(dòng)脈損傷模型制備成功后，分別于損傷后立即（0d），3d，7d，11d尾靜脈注射RAP終濃度為1mg/kg的不同RAP制劑。第14大鼠行安樂(lè)死，灌注后取損傷段血管，切片后HE染色觀(guān)察內(nèi)膜增生情況，免疫組織化學(xué)分析檢測(cè)相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果:
　　1.炎癥響應(yīng)性材料及納米粒的合成和制備
　　以β-CD為原料，采取一步法縮醛反應(yīng)合成了酸響應(yīng)性材料Ac-bCD，F(xiàn)T-

23、IR和1H NMR證實(shí)合成成功。ROS響應(yīng)性材料Ox-bCD則是通過(guò)在β-CD上鍵合氧化敏感響應(yīng)性基團(tuán)PBAP得到，F(xiàn)T-IR和1H NMR證實(shí)合成成功，根據(jù)1H NMR結(jié)果積分計(jì)算表明每個(gè)β-CD分子上結(jié)合有7個(gè)單位的PBAP。以非響應(yīng)性載體材料PLGA為對(duì)照，采用納米沉淀-自組裝法成功制備了三種材料的載RAP納米粒，透射電鏡觀(guān)察示，納米粒呈球形，形態(tài)規(guī)則，粒徑分布均一。馬爾文粒徑儀測(cè)定納米粒粒徑示RAP/PLGA納米粒、RAP/Ac

24、-bCD納米粒和RAP/Ox-bCD納米粒的粒徑分別約為215、238和212nm。
　　2．納米粒的體外水解和藥物釋放實(shí)驗(yàn)
　　相比在PBS（pH7.4）下，Ac-bCD納米粒在pH5.0的PBS中水解迅速，藥物釋放快速，具有良好的酸響應(yīng)性。相比PBS（pH7.4）條件下，Ox-bCD納米粒水解和藥物釋放與H2O2密切相關(guān)，在H2O2存在條件下，材料快速水解，藥物釋放迅速，具有良好的氧化響應(yīng)性。PLGA納米粒在微酸環(huán)境和H

25、2O2環(huán)境下的水解與其在PBS（pH7.4）中的水解和藥物釋放。
　　3．納米粒的細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)
　　激光共聚焦及流式細(xì)胞術(shù)定量分析示，rVSMCs可實(shí)現(xiàn)對(duì)納米粒的吞噬，且呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性，細(xì)胞納米粒吞噬過(guò)程主要由胞內(nèi)內(nèi)涵體/溶酶體介導(dǎo)。
　　4．雷帕霉素不同制劑抗血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移作用的比較
　　載RAP納米制劑較RAP原料藥能更明顯的抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的rVSMCs的增殖和遷移，并且載RAP不同納米

26、粒之間比較，載RAP響應(yīng)性納米粒抑制rVSMCs增殖和遷移能力的效果最顯著。
　　5．大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷部位的ROS水平
　　伊文思藍(lán)染色及HE染色示，大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷部位血管成功去內(nèi)皮化，新生內(nèi)膜形成明顯。與正常血管相比，頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷部位DHE染色顯示超氧陰離子水平明顯升高，損傷部位H2O2和MDA水平顯著升高，提示ROS與內(nèi)膜增生密切相關(guān)。
　　6．三種載體材料納米粒對(duì)大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷部位的靶向情況
　

27、　與正常血管相比較，Cy7.5標(biāo)記的三種不同載體材料構(gòu)建的納米粒均可以在大鼠頸動(dòng)脈損傷段明顯靶向和聚集，且可以滯留較長(zhǎng)時(shí)間。
　　7．雷帕霉素不同制劑抑制頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生的藥效研究
　　載RAP納米制劑較RAP原料藥能更有效的抑制內(nèi)膜增生的程度。另外載RAP不同納米粒之間比較提示，載 RAP響應(yīng)性納米粒組較PLGA納米粒組抑制內(nèi)膜增生的的效果更顯著。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明載RAP炎癥微環(huán)境響應(yīng)性納米粒組SMα-ac

28、tin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目和PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最少，MMP-9的表達(dá)顯著下降。
　　8．響應(yīng)性納米材料的初步安全性評(píng)價(jià)
　　三種材料構(gòu)建的空白納米粒對(duì)rVSMCs活力基本影響。三種材料構(gòu)建的空白納米粒與血液樣本共孵育未見(jiàn)明顯溶血現(xiàn)象發(fā)生。大鼠體內(nèi)急性毒性評(píng)價(jià)提示，尾靜脈注射500mg/kg響應(yīng)性空白納米粒后14d，未見(jiàn)明顯動(dòng)物行為異常，體重，臟器指數(shù)，血常規(guī)，血生化指標(biāo)（肝腎功標(biāo)志物）與生理鹽水對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，主要臟器HE染色

29、未見(jiàn)明顯病理學(xué)改變。提示響應(yīng)性納米材料體內(nèi)安全性良好。
　　研究結(jié)論:
　　1.基于β-環(huán)糊精成功合成酸響應(yīng)性的Ac-bCD材料和ROS響應(yīng)性的Ox-bCD材料，并成功制備了相應(yīng)載RAP納米粒。
　　2.不同載體材料構(gòu)建的納米粒均能被rVSMCs有效吞噬。載RAP炎癥微環(huán)境響應(yīng)性納米粒能夠顯著抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的rVSMCs增殖和遷移
　　3.構(gòu)建的炎癥微環(huán)境響應(yīng)性納米?？砂邢蚓奂诖笫箢i動(dòng)脈球囊損傷部位。<