熱帶假絲酵母單糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆鑒定及功能研究.pdf

1、能源是人類生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎，其中液體形態(tài)的燃料石油已成為現(xiàn)代文明賴以生存的“血液”。然而，地球上的石油資源有限，并呈現(xiàn)枯竭之勢。為了尋求替代資源，人們把目光集中到了生物燃料乙醇上。目前，國內(nèi)外最為關注的是以木質(zhì)纖維素水解液為原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。該水解液中主要包括葡萄糖、甘露糖和半乳糖等六碳糖，以及木糖和少量阿拉伯糖等五碳糖。然而，乙醇發(fā)酵最為優(yōu)良的釀酒酵母不能對上述這些木質(zhì)纖維素水解單糖進行全組分利用，所以必須對其進行基因工程改造。其

2、中，單糖的跨膜轉(zhuǎn)運是決定糖是否能被釀酒酵母代謝利用的第一步，也被認為是最為關鍵的一步。因此，發(fā)掘優(yōu)良的單糖轉(zhuǎn)運蛋白并對它們進行功能研究顯得尤為重要。
　　本實驗以具有優(yōu)良糖代謝能力的熱帶假絲酵母SHC-03(Candida tropicalisSHC-03)為研究材料，首先研究了它對不同單糖的利用能力;其次，根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫中的基因預測及注釋結(jié)果，從全基因組6254個功能基因中篩選出了15個可能具有糖轉(zhuǎn)運蛋白功能的基因作為研究對

3、象，將這些基因在釀酒酵母工程菌中實現(xiàn)了異源表達，進行了功能互補實驗;然后，分析了熱帶假絲酵母菌體內(nèi)的這些基因在木糖、葡萄糖以及混合糖源條件下的轉(zhuǎn)錄變化;最后，對鑒定出的單糖轉(zhuǎn)運蛋白進行了結(jié)構(gòu)預測及系統(tǒng)進化分析。該研究獲得了以下結(jié)果:
　　(1)通過對熱帶假絲酵母在不同糖源條件下的生長分析，發(fā)現(xiàn)熱帶假絲酵母具有較廣的糖源利用能力。它不僅可以很好地利用六碳糖中的葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖等，而且還能利用五碳糖中的木糖以及二糖中的蔗糖

4、和纖維二糖等。從熱帶假絲酵母6254個功能基因中預測篩選出了15個目的基因，對它們進行了克隆并構(gòu)建表達載體，轉(zhuǎn)入一株敲除所有單糖轉(zhuǎn)運蛋白基因但引入了木糖代謝途徑的釀酒酵母(S.cerevisiae YXI)中進行功能互補驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在15個候選基因中，CTRG_00554，CTRG_01164，CTRG_01165，CTRG_01648和CTRG_04615這5個基因表現(xiàn)出糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的功能，被鑒定為新的糖轉(zhuǎn)運蛋白基因。通過分析克隆

5、表達菌株生長速率的差異，發(fā)現(xiàn)不同的糖轉(zhuǎn)運蛋白表現(xiàn)出對不同單糖轉(zhuǎn)運的偏好性。這5個糖轉(zhuǎn)運蛋白均可以轉(zhuǎn)運葡萄糖、果糖和木糖，其中CTRG_01648p對葡萄糖和木糖的轉(zhuǎn)運能力最強，CTRG_01164p對果糖的轉(zhuǎn)運能力最強。CTRG_00554p，CTRG_01648p和CTRG_04615p可以轉(zhuǎn)運除了核糖以外本實驗中的所有單糖;CTRG_00554p對木糖和甘露糖的利用能力較好;CTRG_01648p和CTRG_04615p為高效的糖轉(zhuǎn)

6、運蛋白，對葡萄糖、甘露糖、果糖和木糖均有較強的轉(zhuǎn)運能力，而且CTRG_01648p轉(zhuǎn)運這4種糖的能力均明顯優(yōu)于對照ScHXT7p。本實驗未發(fā)現(xiàn)專一的木糖轉(zhuǎn)運蛋白。
　　(2)在木糖、葡萄糖和混合糖三種條件下，本實驗對15個候選基因的表達水平進行了研究。結(jié)果表明CTRG_00554, CTRG_0l165，CTRG_01322, CTRG_01648，CTRG_02338，CTRG_03572，CTRG_04303和CTRG_062

7、50等8個基因在三種條件下均被誘導表達，其中CTRG_00554和CTRG_04303在木糖條件下的表達量比在葡萄糖條件下的表達量高15倍以上，表現(xiàn)出顯著的木糖誘導表達。CTRG_01164p和CTRG_04615p雖然表現(xiàn)出對葡萄糖和木糖的轉(zhuǎn)運能力，但是這兩個基因在木糖、葡萄糖和混合糖三種條件下的表達量均無升高。CTRG_01322，CTRG_02338，CTRG_03572，CTRG_04303和CTRG_06250等5個無糖轉(zhuǎn)運功

8、能的基因也表現(xiàn)出了誘導表達，它們的具體功能有待進一步研究。
　　(3)15個候選糖轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)的預測表明，它們的結(jié)構(gòu)均符合MFS(Majorfacilitator superfamily)超家族的特點。以最大似然法將它們與目前已知的糖轉(zhuǎn)運蛋白進行蛋白序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類結(jié)果顯示15個候選蛋白中有糖轉(zhuǎn)運蛋白功能的5個蛋白被分成了三組。結(jié)合前人的報道發(fā)現(xiàn)A、B、C這三組糖轉(zhuǎn)運蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上有各自的特點。
　　本論文