EP3受體激活對膀胱興奮性影響的作用機制初探.pdf

1、背景及目的:許多臨床疾病可以導致膀胱過度活動癥(Overactive Bladder，OAB)，比如泌尿系統(tǒng)的感染、神經源性膀胱、間質性膀胱炎以及膀胱痛疼綜合征等，除此之外，OAB也可以單獨發(fā)生。OAB的病人以尿急為主要癥狀，常伴有尿頻和夜尿增多，同時也會有尿失禁的發(fā)生，常常給病人帶來生活上的痛苦和不便，長期的OAB還可引起輸尿管積水和腎積水，嚴重損害腎功能。關于OAB的發(fā)病機理一直未能明確闡述，臨床上OAB的治療也一直著重于作用在神經

2、受體M受體的藥物，但治療效果有限。所以關于OAB的研究一直受到眾多的關注。在OAB的研究過程中，Joon Chul Kim發(fā)現在OAB的病人膀胱中前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)的分泌水平增高，提示PGE2是OAB疾病發(fā)生發(fā)展的一個重要因素。隨后的研究也發(fā)現PGE2可以使膀胱逼尿肌的收縮頻率和幅度增強，但PGE2作用于膀胱引起膀胱過度活動的具體機制未能明確，推測PGE2的受體在其中發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現PGE

3、2的受體EP3可以影響膀胱的排尿間隔和排尿量，同時，在EP3受體基因敲除的小鼠中，也發(fā)現膀胱排尿量增加;向小鼠的膀胱內灌注PGE2可以引起膀胱的過度活動，但在EP3受體敲除小鼠的膀胱中灌注PGE2卻并不能引起膀胱的過度活動。這些研究的發(fā)現提示EP3受體在膀胱過度活動中的重要作用，但EP3受體激活后對膀胱活動的機制研究同樣也未有實質性的進展。
　　膀胱的逼尿肌興奮性異常是膀胱逼尿肌過度活動（Detrusor Overactivity

4、，DO）的重要原因，膀胱過度活動癥與逼尿肌過度活動有密切聯系，所以研究膀胱逼尿肌興奮性的機制將對膀胱過度活動癥具有重要意義。許多年來，一直認為膀胱逼尿肌的興奮性受到膀胱神經的支配，但隨著研究的深入，尤其是有研究發(fā)現離體膀胱存在節(jié)律性的收縮，人們認為膀胱逼尿肌興奮性的神經支配學說存在局限性，在膀胱中存在獨立于神經支配的自發(fā)興奮調控系統(tǒng)，并吸引越來越多的研究和關注。隨后，Smet在人體和豚鼠膀胱中發(fā)現c-GMP免疫陽性的細胞在形態(tài)上類似于腸

5、道的卡哈爾間質細胞(interstitial cells of Cajal，ICC)，之后通過ICC細胞的特異性標記c-kit證實了膀胱ICC細胞的存在。在腸道中，ICC細胞具有起搏功能，能夠將自身產生的細胞興奮通過其與平滑肌細胞間的緊密連接傳遞到整個組織，是腸道慢波蠕動的發(fā)起者和控制者。ICC細胞的這些特點，吸引了人們的關注和研究。人們認為在膀胱中，ICC細胞同樣具有起搏功能，能夠產生細胞興奮，同時，這也能很好的解釋膀胱在去除神經因素

6、的情況下仍能夠產生自發(fā)收縮的現象。在膀胱活動不穩(wěn)定的病人膀胱內，有研究發(fā)現ICC細胞的數量增多，也提示ICC細胞在膀胱興奮中占據重要地位。對于ICC細胞的深入研究將對膀胱興奮調控機制以及膀胱的過度活動具有重要意義。
　　在對膀胱ICC細胞的研究過程中，發(fā)現了在膀胱ICC細胞中存在超極化電壓門控通道（HCN通道），該通道有4種亞型，能夠在細胞超極化的情況下被激活，在通道激活后，鈉離子和鉀離子能夠通過該通道進入細胞內，從而形成一種內向

7、電流，由于該通道的特殊的激活方式，其形成的這種內向電流被命名為“funny current”(If)。正是If的存在，使得細胞能夠產生動作電位，自發(fā)產生興奮。HCN通道首先在心肌細胞和神經細胞中被發(fā)現，同時其If也被證實在心肌細胞和神經細胞興奮調控中的重要作用。目前的研究證實，HCN通道在膀胱中有且僅在膀胱ICC細胞上有表達，通過蛋白定量等實驗也發(fā)現，HCN1通道的表達量最為顯著，而HCN2、HCN3和HCN4通道的表達量相對較少。膀胱

8、ICC細胞上HCN通道表達的發(fā)現，為膀胱ICC細胞可自發(fā)產生細胞興奮提供了進一步的證據，同時也為研究ICC細胞興奮的產生和調控提供了新的思路和方向。但關于膀胱中HCN通道的調控一直沒有明確的研究與發(fā)現。
　　綜上所述，我們看到EP3受體的激活對膀胱功能具有顯著的作用，而基于HCN通道作用的ICC細胞自發(fā)興奮又在膀胱興奮調控中起到重要的作用，我們擬研究EP3受體的激活能否通過作用于ICC細胞上的HCN通道，影響了ICC細胞的興奮性調

9、控，進而對膀胱的功能產生影響與作用。通過揭示EP3受體激活的作用機制，既進一步地闡明了膀胱興奮調控機制，又為臨床膀胱疾病治療提供了新的靶點。
　　方法:
　　第一部分、EP3受體在膀胱ICC細胞上的表達
　　在這一部分中，我們擬采用免疫熒光雙染的實驗技術，對EP3蛋白和ICC細胞特異性標記c-kit進行免疫標記，以確定EP3受體在ICC細胞上的表達。
　　第二部分、EP3受體對HCN通道的影響作用
　　(1

10、)我們首先建立EP3受體特異性激動劑sulprostone的小鼠膀胱灌注模型，再利用Western blotting的實驗方法比較正常小鼠膀胱中HCN表達情況和進行了sulprostone膀胱灌注的小鼠膀胱中HCN的表達情況;
　　(2)我們將小鼠膀胱進行急性酶分離，將獲得的膀胱ICC細胞利用膜片鉗技術檢測EP3受體的激動劑PGE2和sulprostone對HCN通道電流的影響;
　　(3)我們利用單細胞PCR技術對我們在膜

11、片鉗實驗中所用到的細胞進行c-kit的檢測，以保證我們實驗中記錄的細胞確實為ICC細胞;
　　(4)免疫共沉淀技術用來檢測EP3受體蛋白和HCN通道蛋白是否存在直接的相互作用，以探究EP3受體激活作用于HCN通道的方式方法。
　　第三部分、EP3受體激活對膀胱ICC細胞興奮性的影響
　　在此部分實驗中，我們首先對小鼠的膀胱ICC細胞進行分離培養(yǎng)，利用鈣負載技術，通過加入EP3受體的激動劑PGE2和sulprostone

12、以及HCN通道的阻滯劑ZD7288檢測EP3受體激活對膀胱ICC細胞興奮性的影響，以及這種作用是否通過HCN通道實現。
　　第四部分、EP3受體激活對膀胱肌肉收縮功能的影響
　　在這一部分實驗中，我們加入了HCN1基因敲除小鼠，利用離體膀胱肌條實驗探究EP3受體的激活對膀胱肌肉收縮功能的作用及影響，并探究這種作用是否通過ICC細胞上的HCN通達完成。
　　結果:
　　(1)免疫熒光雙染實驗顯示，EP3受體在膀胱I

13、CC細胞上有表達;
　　(2)Western blotting實驗顯示，在用EP3受體特異性激動劑sulprostone進行膀胱灌注的小鼠膀胱中，HCN1和HCN4通道的表達量比正常小鼠膀胱組織中高，而HCN2和HCN3通道則沒有差異性;
　　(3)膜片鉗實驗顯示，EP3受體的激動劑PGE2和sulprostone均可以使HCN通道的電流增強;
　　(4)免疫共沉淀實驗顯示，EP3受體蛋白和HCN1及HCN4蛋白存在直

14、接作用;
　　(5)鈣負載實驗結果顯示EP3受體激活后會使膀胱ICC細胞內的鈣離子濃度增加，而EP3受體的這種作用可以被HCN通道的阻滯劑ZD7288所阻斷;
　　(6)在離體膀胱肌條實驗中，EP3受體激動劑PGE2和sulprostone均能夠使正常小鼠的膀胱肌肉收縮幅度增強，而且這種作用都可以被HCN通道阻滯劑所阻斷;
　　(7)通過離體膀胱肌條實驗發(fā)現，預先在EP3受體阻滯劑L798106的作用下，PGE2對大鼠

15、的膀胱肌肉收縮功能沒有影響;
　　(8)通過離體膀胱肌條實驗，EP3受體激動劑PGE2和sulprostone均可以使HCN1基因敲除小鼠的膀胱肌肉收縮幅度增強，但是PGE2和sulprostone的作用效果均不如在正常小鼠膀胱中的作用效果。
　　結論:
　　(1)在膀胱ICC細胞上有EP3受體的表達;
　　(2)EP3受體蛋白能夠直接作用于HCN通道蛋白，從而增強HCN通道的表達和功能;
　　(3)EP3