CtBP參與Polycomb靶基因調(diào)控的作用機制研究.pdf

1、C-terminal binding proteins(CtBPs)是一類經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄共阻遏因子，在生物體的生長發(fā)育和疾病的形成過程中發(fā)揮重要的功能。CtBPs涉及細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生，可能會成為癌癥研究的重要靶向蛋白之一。Polycomb(Pc)蛋白是Polycomb group(PcG)復(fù)合體中的一員。PcG蛋白作為一類最為重要的轉(zhuǎn)錄阻遏因子之一，也表現(xiàn)出在多細胞生物的發(fā)育中的核心地位。例如，PeG阻遏

2、Hox基因的表達對體節(jié)的形成至關(guān)重要；最近的研究還表明，PcG在胚胎干細胞的分化過程中起關(guān)鍵作用。哺乳動物的研究表明CtBP可能參與PcG介導(dǎo)的靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用，但具體機制尚不十分清楚。而果蠅體內(nèi)CtBP是否影響Pc的轉(zhuǎn)錄抑制，目前尚未見報道。
　　本文以果蠅為模式生物，用遺傳學的方法進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CtBP能拮抗Pc介導(dǎo)的同源異型基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用。PcG成員的雜合突變會產(chǎn)生同源異型轉(zhuǎn)化的表型，即在雄性果蠅的第二及第三對足

3、上出現(xiàn)多余的性梳，而CtBP突變體本身不具有PcG家族成員突變后導(dǎo)致的同源異型轉(zhuǎn)化的表型。當本實驗室在CtBP雜合突變的背景下引入PcG家族成員Pc的雜合突變，卻發(fā)現(xiàn)CtBP雜合突變能減弱了Pc雜合突變所導(dǎo)致的表型，這從遺傳學的角度上說明，CtBP是Pc調(diào)節(jié)同源異型基因轉(zhuǎn)錄抑制的拮抗因子。這個研究結(jié)果出乎研究者的預(yù)料，因為和脊椎動物的結(jié)果是相反的。
　　為了探索CtBP拮抗Pc的轉(zhuǎn)錄抑制作用的具體分子機制，本實驗室緊接著研究了兩者

4、的相互作用。本實驗室通過免疫共沉淀以及GST Pull-down的實驗證明了CtBP與Pc存在著相互作用，即表明CtBP對Pc轉(zhuǎn)錄抑制的拮抗作用可能是通過它們之間的相互作用所介導(dǎo)的。
　　隨后，本實驗室在細胞水平進行了RNAi實驗，初步探討了CtBP對Pc介導(dǎo)的靶基因的轉(zhuǎn)錄阻遏的拮抗作用。本實驗室前期研究表明，Pc對其靶基因pannier(pnr)和caudal(cad)具有轉(zhuǎn)錄阻遏作用，對Pc進行RNAi可以使pnr和cad的轉(zhuǎn)

5、錄顯著地去阻遏。因此，本實驗室對CtBP和Pc同時進行了RNAi干擾，實驗結(jié)果表明，只干擾CtBP時，pnr和cad的轉(zhuǎn)錄與Ctrl相同，都受到阻遏；只干擾Pc時，pnr和cad的轉(zhuǎn)錄會顯著地去阻遏；而當研究者同時干擾CtBP和Pc時，pnr和cad的轉(zhuǎn)錄又受到了明顯的阻遏。以上結(jié)果表明：CtBP能拮抗Pc介導(dǎo)的靶基因pnr和Cad的轉(zhuǎn)錄抑制作用。另一方面，當CtBP和Pc分別進行RNAi干擾后，Pc的靶基因rpr、wg、pnt、h和g

6、t的轉(zhuǎn)錄是受阻遏的，而當CtBP和Pc同時進行RNAi干擾之后，rpr、wg、pnt、h和gt的轉(zhuǎn)錄是去阻遏的。說明CtBP對Pc的靶基因的調(diào)節(jié)存在基因特異性。
　　綜上所述，本研究工作發(fā)現(xiàn)了CtBP能拮抗Pc介導(dǎo)的同源異型基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用。為了進一步探討CtBP拮抗Pc轉(zhuǎn)錄抑制的具體機制，本實驗室分別在果蠅細胞水平和體外進行了一定的研究。體外蛋白質(zhì)相互作用實驗則證明了CtBP與Pc之間確實存在相互作用；果蠅細胞水平的RNAi干