CTRP9對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展的作用及機(jī)制研究.pdf

1、1研究背景
　　心腦血管疾病是目前世界范圍內(nèi)致殘、致死的首位原因，其病理基礎(chǔ)主要是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)。大量研究已證實(shí)AS是一種主要累及大中血管壁的慢性炎癥和代謝性疾病。AS的病理生理過(guò)程十分復(fù)雜，目前其發(fā)病機(jī)制仍有待于進(jìn)一步闡明。
　　自噬是真核生物在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的依賴溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)自身細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的自我保護(hù)過(guò)程。隨著研究的進(jìn)展，目前認(rèn)為自噬在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色，多

2、種AS危險(xiǎn)因素均可引起自噬功能紊亂。自噬在AS中可以參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、代謝、炎癥和凋亡等過(guò)程。適度水平的自噬對(duì)AS起保護(hù)性作用，因此調(diào)節(jié)自噬水平或許能成為治療動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)性心血管疾病的重要靶點(diǎn)。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(themammaliantargetofrapamycin,mTOR)是雷帕霉素在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的靶分子，mTOR在細(xì)胞內(nèi)存在mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合體，其中mTORC1參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)和自噬等過(guò)程。抑

3、制mTORC1可以通過(guò)多種途徑發(fā)揮AS保護(hù)作用，如改善內(nèi)皮功能紊亂、抑制單核細(xì)胞粘附和聚集、減少斑塊內(nèi)泡沫細(xì)胞形成、降低巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)以及延緩平滑肌細(xì)胞增殖和遷移等。腺苷酸活化蛋白激酶(adenosinemonophosphate-activatedproteinkinase，AMPK)作為真核細(xì)胞的一個(gè)重要能量感受器，活化后可以負(fù)性調(diào)節(jié)mTORC1的活性，從而上調(diào)自噬水平。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，活化AMPK或者抑制mTOR或?yàn)閯?dòng)脈粥樣

4、硬化防治的新靶點(diǎn)。
　　C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白9（C1q/TNF-relatedprotein9，CTRP9）是CTRP超家族中的新型脂肪細(xì)胞因子，與脂聯(lián)素(adiponectin，APN)高度同源。研究顯示CTRP9在調(diào)節(jié)代謝、保護(hù)心肌、改善內(nèi)皮功能及抵抗糖尿病心血管損害等方面發(fā)揮重要作用。越來(lái)越多的研究展現(xiàn)出了CTRP9對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)性作用。CTRP9可以通過(guò)調(diào)控平滑肌細(xì)胞增殖和遷移過(guò)程延緩血管損傷后病理性血管重塑。

5、同時(shí)，CTRP9可以通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)降低心肌損傷。此外，血清CTRP9水平可作為一個(gè)獨(dú)立于APN的預(yù)測(cè)因素評(píng)估心血管事件的發(fā)生。我們前期研究顯示，與健康對(duì)照人群相比，急性冠脈綜合癥(acutecoronarysyndrome，ACS)患者血清中CTRP9和APN水平均降低，并且CTRP9和APN的血清水平與ACS病變嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在AS易損斑塊模型小鼠中，CTRP9可增加AS易損斑塊的穩(wěn)定性。近期研究顯示

6、，在人原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞中，CTRP9可以上調(diào)自噬水平，而自噬抑制劑3-MA可以部分抵消CTRP9對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡和肝脂肪變性的作用。本研究擬從自噬的角度探討CTRP9在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用及可能機(jī)制。
　　2研究目的
　　(1)研究外源性CTRP9干預(yù)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)生發(fā)展的影響;
　　(2)探討CTRP9參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)生發(fā)展過(guò)程的可能機(jī)制。
　　3研究方法
　　3.1動(dòng)脈粥樣硬化早期斑塊

7、模型的建立
　　8周齡雄性ApoE-/-小鼠購(gòu)自北京維通利華公司，給予1周適應(yīng)性普食后改為高脂喂養(yǎng)（0.25％膽固醇和15％黃油）。4周后隨機(jī)分為3組:CTRP9慢病毒過(guò)表達(dá)組（Lv-CTRP9組），慢病毒空載體干預(yù)組（Lv-eGFP組）和PBS對(duì)照組（Control組），Lv-CTRP9組每只小鼠尾靜脈注射2×107TU攜帶CTRP9的慢病毒，Lv-eGFP組和Control組分別注射等體積的空載體慢病毒及無(wú)菌PBS。
　

8、　3.2小鼠血清學(xué)檢測(cè)
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠安樂(lè)死并于心尖部取血，離心后收集上層血清。ELISA法檢測(cè)血清中炎癥因子MCP-1和TNF-α的表達(dá)水平，并檢測(cè)血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的水平。
　　3.3組織病理學(xué)檢測(cè)
　　小鼠安樂(lè)死后，取小鼠主動(dòng)脈根部OCT包埋，以5μm厚度連續(xù)切片制作主動(dòng)脈根部冰凍切片，行HE染色觀察斑塊形態(tài)，油紅O染色

9、檢測(cè)主動(dòng)脈根部脂質(zhì)含量。同時(shí)取小鼠主動(dòng)脈行大體油紅O染色。病變的嚴(yán)重程度用總斑塊面積占相應(yīng)主動(dòng)脈面積的百分比表示。
　　3.4免疫組織化學(xué)染色
　　取主動(dòng)脈根部冰凍切片，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)主動(dòng)脈根部斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的含量。Image-ProPlus6.0軟件計(jì)算陽(yáng)性染色面積占相應(yīng)斑塊面積的百分比。
　　3.5Westernblot
　　取新鮮小鼠主動(dòng)脈組織標(biāo)本，分別提取蛋白，用Westernblot方法

10、檢測(cè)MCP-1、TNF-α、LC3B、SQSTM1/p62以及p-AMPK、p-mTOR等表達(dá)水平的變化。
　　3.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行多組間統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4結(jié)果
　　4.1CTRP9慢病毒轉(zhuǎn)染可以增加血清中CTRP9的表達(dá)
　　小鼠尾靜脈慢病毒注射1周后取材，小鼠主動(dòng)脈

11、根部斑塊內(nèi)可見(jiàn)GFP熒光顯著表達(dá)。Westernblot結(jié)果顯示，Lv-CTRP9組血清中CTRP9蛋白表達(dá)明顯高于Lv-eGFP組與Control組(p＜0.05)，而Lv-eGFP組和Control組未見(jiàn)顯著差異(p＞0.05)。
　　4.2CTRP9對(duì)小鼠血脂水平的影響
　　Lv-CTRP9組、Lv-eGFP組小鼠和Control組三組小鼠之間血脂水平未見(jiàn)顯著性差異(p＞0.05)。
　　4.3CTRP9過(guò)表達(dá)可

12、減少ApoE-/-小鼠AS斑塊面積
　　小鼠主動(dòng)脈大體油紅O染色顯示，Lv-CTRP9組較Lv-eGFP組和Control組的主動(dòng)脈斑塊面積顯著減少(p＜0.05)，主動(dòng)脈根部油紅O染色及HE染色結(jié)果與大體油紅O一致(p＜0.05)。
　　4.4CTRP9可以降低斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)
　　免疫組化結(jié)果顯示，Lv-CTRP9組斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞含量較Lv-eGFP組和Control組降低(p＜0.05)，而Lv-eGFP組和C

13、ontrol組間無(wú)明顯差異(p＞0.05)。
　　4.5CTRP9可以降低斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞聚集
　　免疫組化結(jié)果顯示，Lv-CTRP9組斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞含量較Lv-eGFP組和Control組降低(p＜0.05)，而Lv-eGFP組和Control組間無(wú)顯著差異(p＞0.05)。
　　4.6CTRP9可以抑制ApoE-/-小鼠炎癥因子的表達(dá)
　　Westernblot結(jié)果顯示，與Lv-eGFP組和Control組

14、相比，Lv-CTRP9組小鼠主動(dòng)脈組織內(nèi)炎癥因子MCP-1和TNF-α蛋白的表達(dá)下降(p＜0.05)，而Lv-eGFP組和Control組間未見(jiàn)顯著差異(p＞0.05)。同時(shí)，ELISA結(jié)果顯示，與兩對(duì)照組相比，CTRP9可以降低血清中MCP-1和TNF-α的表達(dá)水平(p＜0.05)，而兩對(duì)照組間無(wú)顯著差異(p＞0.05)。
　　4.7CTRP9對(duì)ApoE-/-小鼠自噬水平的影響
　　Westernblot結(jié)果顯示，與Lv-

15、eGFP組和Control組相比，Lv-CTRP9組小鼠主動(dòng)脈組織內(nèi)LC3B-Ⅱ表達(dá)增加而SQSTM1/p62表達(dá)降低(p＜0.05)，兩對(duì)照組間未見(jiàn)顯著差異(p＞0.05)。
　　4.8AMPK/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)了CTRP9對(duì)自噬水平的調(diào)節(jié)
　　Westernblot結(jié)果顯示，與Lv-eGFP組和Control組相比，Lv-CTRP9組AMPK磷酸化水平增加(p＜0.05)，mTOR磷酸化水平降低(p＜0.05)，而L