乳鏈菌肽抗性蛋白突變體的表達對乳鏈菌肽產(chǎn)量的影響.pdf

1、乳鏈菌肽(nisin)是由某些乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)產(chǎn)生的含有34個氨基酸的陽離子抗菌多肽，屬于第一類羊毛硫細(xì)菌素，可有效抑制包括多種食物腐敗菌和病原菌在內(nèi)的革蘭氏陽性菌，并可被人體產(chǎn)生的a-胰凝乳蛋白酶有效降解，對人體安全無毒，是目前唯一大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用的高效天然食品防腐劑。
　　 在nisin產(chǎn)生菌中，nisin的抗性（免疫）是由nisI編碼的脂蛋白(NisI)和nisFEG編碼的ABC轉(zhuǎn)運蛋白復(fù)

2、合體(NisFEG)共同決定的；然而，在一些不產(chǎn)nisin的L.lactis中，nisin抗性則是由nisin抗性基因（nisin resistance gene，nsr）編碼的一個分子量約為35kDa的nisin抗性蛋白(NSR)決定的。本研究通過基因工程的手段，采用定點突變的方法將nisin抗性基因nsr進行突變，并對突變后的抗性基因編碼的蛋白生理功能進行了研究，根據(jù)其特有的生理功能又將該突變體蛋白在nisin產(chǎn)生菌中進行克隆與表達

3、。研究取得了如下結(jié)果：
　　 1)nisin抗性基因nsr的定點突變：對基因nsr編碼蛋白NSR的保守結(jié)構(gòu)域進行分析，發(fā)現(xiàn)其第236位絲氨酸在所有末端特異性蛋白酶中均保守，可能為其活性中心。因此將NSR第236位絲氨酸突變?yōu)楸彼?記為NSRS236A)。
　　 2)抗性蛋白突變體NSRS236A的生理功能研究：本文構(gòu)建了表達NSRS236A的L.lactis MG1363重組菌株，用以研究該蛋白的生理功能。Wester

4、n blot雜交結(jié)果顯示，和NSR一樣，NSRS236A特異性定位于細(xì)胞膜上；肽釋放實驗表明突變體NSRS236A不再具備有降解nisin的功能；表面等離子共振檢測表明NSRS236A能與nisin結(jié)合。
　　 3)NSRS236A的表達對nisin產(chǎn)量的影響：利用nisin抗性蛋白突變體NSRS236A可以結(jié)合nisin分子而不會對其行使降解功能的特點，將帶有強組成型啟動子P59的抗性基因nsr S36A克隆到nisin表達質(zhì)

5、粒pHJ201上，將重組質(zhì)粒引入L．lactis NZ9800中，使nsr S36A基因得以表達，比較重組菌株L.lactis NZ9800/pHM582與對照菌株L.lactis NZ9800/pHJ201的生長曲線、對nisin的抗性水平、抑菌活性及nisin產(chǎn)量的差異。結(jié)果表明NSRS236A的表達對重組菌的生長速度沒有明顯的影響，但卻能促使重組菌株對nisin的抗性水平提高40％，對指示菌Mflavus NCIB8166抑菌活性

6、在6h和8h時明顯增強，nisin的表達量分別提高1.9倍和27％。
　　 本項研究結(jié)果突出地表現(xiàn)在：定位于細(xì)胞膜上的NSRS236A通過結(jié)合細(xì)胞表面nisin分子，在細(xì)胞表面阻止nisin對自身菌體的破壞，增強了菌體對nisin的抗性水平，提高了nisin的表達量。
　　 以上結(jié)果說明nisin抗性蛋白突變體NSRS236A的表達可以提高產(chǎn)生菌對nisin的抗性，從而提高nisin產(chǎn)量，為通過基因工程手段提高nisin