槭屬植物SRAP技術(shù)體系的建立及其遺傳多樣性研究.pdf

1、槭屬（AcerL．）是槭樹科（Aceraceae）植物，我國是世界上槭樹分布種類最多的國家，是世界槭樹的現(xiàn)代分布中心，擁有豐富的種質(zhì)資源。但長期以來，關(guān)于槭屬植物在分子標(biāo)記上的親緣關(guān)系的研究就相對(duì)較少，本研究將SRAP這種新的DNA分子標(biāo)記運(yùn)用到槭屬植物的遺傳多樣性研究上，以期從DNA水平上明確槭屬植物種間親緣關(guān)系和分類地位，為槭屬植物種質(zhì)資源的科學(xué)利用提供依據(jù)。 本試驗(yàn)以槭屬植物的葉片為材料，通過對(duì)不同的DNA提取方法對(duì)比，探

2、討最佳的槭屬植物DNA提取方法；同時(shí)對(duì)槭屬植物的SRAP技術(shù)體系進(jìn)行優(yōu)化，并將該技術(shù)體系應(yīng)用于22個(gè)槭屬植物材料的SRAP擴(kuò)增分析中。本試驗(yàn)研究結(jié)果如下： 1．本試驗(yàn)采用常規(guī)CTAB法和改良CTAB法兩種方法對(duì)槭屬植物葉片DNA提取結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，采用常規(guī)的CTAB法所得的DNA量很少、DNA帶弱、點(diǎn)樣孔中有蛋白質(zhì)存在、拖帶現(xiàn)象也較嚴(yán)重，且DNA完整性差，在后期進(jìn)行SRAP擴(kuò)增時(shí)，雜質(zhì)導(dǎo)致擴(kuò)增不穩(wěn)定或者擴(kuò)增失敗。而采用改良CTAB

3、方法提取的條帶很整齊、DNA質(zhì)量較高、蛋白質(zhì)少、無拖帶現(xiàn)象、基因組完整性比較好。 使用改良CTAB提取法有效地解決了槭屬植物基因組總DNA提取中的褐變和多酚、多糖和蛋白質(zhì)等次生物質(zhì)干擾等問題。從檢測(cè)所得純度可知該DNA模板完全可以用于SRAP分析；另外，該方法還具有成本低、操作簡(jiǎn)單、省時(shí)等特點(diǎn)。 2．優(yōu)化建立了適用于槭屬植物DNA分析的SRAP技術(shù)體系 本試驗(yàn)以槭屬植物基因組DNA為模板，通過Mg2+、dNTPs

4、、Primer、DNA與Taqpolymerase進(jìn)行梯度試驗(yàn)，對(duì)槭屬植物SRAP反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，建立了適合于槭屬植物的SRAP-PCR反應(yīng)體系，該體系總體積為25μL：Mg2+2．5mmol·L，dNTPs0．25mmol·L-，Primer80ng，Taqpolymerase1．5U，DNA40ng。 SRAP-PCR優(yōu)化反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性5min；94℃變性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min，共5個(gè)循環(huán)

5、；94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min；4℃保存。結(jié)果表明該體系和程序可滿足槭屬植物基因組SRAP擴(kuò)增的要求。 3．多態(tài)性引物對(duì)篩選 利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和程序，從64個(gè)引物對(duì)中篩選出重復(fù)性好的、譜帶清晰穩(wěn)定的引物對(duì)24對(duì)。每個(gè)引物對(duì)產(chǎn)生擴(kuò)增譜帶4～13條，共產(chǎn)生擴(kuò)增譜帶169條，平均每個(gè)引物對(duì)產(chǎn)生譜帶7．04條。其中每個(gè)引物對(duì)產(chǎn)生多態(tài)性譜帶3～10條，共產(chǎn)生多態(tài)性

6、譜帶107條，平均每個(gè)引物對(duì)產(chǎn)生多態(tài)性譜帶4．46條。每個(gè)引物對(duì)的多態(tài)性比率在54％～83％2間，平均每個(gè)引物對(duì)的多態(tài)性比率為63％。 4．用篩選出的部分引物對(duì)22個(gè)槭屬植物的DNA模板進(jìn)行SRAP擴(kuò)增，得到了穩(wěn)定的SRAP譜帶。這些引物對(duì)各種材料擴(kuò)增所得到的特征譜帶反映了基因組總DNA堿基序列的特異性，表明這些引物可用于其他分析。 5．采用遺傳距離和UPGMA法對(duì)擴(kuò)增出的譜帶進(jìn)行遺傳聚類分析，得出反映各種間親緣關(guān)系的樹