褪黑素對膠質(zhì)瘤干細胞的影響及機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、膠質(zhì)細胞瘤是一種顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤,其發(fā)病率高,占所有顱內(nèi)腫瘤的50%以上。由于膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長,侵襲性強,所以手術難以完全切除,治療效果差,往往預后不良。WHO將膠質(zhì)瘤分為4級,級別越高則惡性程度就越高。其中級別最高的膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)為WHOⅣ級,該腫瘤發(fā)病率高,約占到所有顱內(nèi)腫瘤的15%。在膠質(zhì)母細胞瘤盡可能手術切除的前提下,再輔以標準的放化療,病人的中位生存期仍然不超過15個月。
  近年來的研究表明,膠質(zhì)瘤,特別是惡性

2、程度最高的膠質(zhì)母細胞瘤中含有一種細胞亞群,這種細胞亞群擁有部分正常干細胞的特性,被稱為膠質(zhì)瘤干細胞(glioblastoma stem-like cells,GSCs)。GSCs起到了極強的促進膠質(zhì)母細胞瘤增殖的作用,同時GSCs在促進腫瘤向顱內(nèi)周圍腦組織浸潤、擴散的過程中起到了關鍵作用。目前手術綜合放化療并不能有效的殺滅GSCs,這導致腫瘤往往會較快復發(fā),預后不良,所以亟需探索能夠有效殺滅GSCs的治療手段。
  褪黑素是一種由

3、松果體分泌的激素。長期以來,褪黑素一直被認為是一種調(diào)節(jié)生物節(jié)律的激素,而近年來越來越多的研究證明,褪黑素對多種腫瘤均具有抑制作用,其中便包括膠質(zhì)瘤。然而褪黑素對GSCs的作用還少有研究,其機制也尚不明確。
  EZH2具有組蛋白甲基化轉移酶作用,是多梳蛋白復合體2的組分之一。在包括膠質(zhì)瘤、乳腺癌、胃癌、結腸癌在內(nèi)的多種腫瘤中,均發(fā)現(xiàn)了EZH2的異常升高。并且EZH2的表達量越高,腫瘤往往惡性程度越高,預后越發(fā)不良,而抑制EZH2的

4、表達能夠延緩腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。同時已經(jīng)有確切證據(jù)表明,EZH2是GSCs的干性指標之一。NOTCH受體的過表達也存在于包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤中。EZH2-NOTCH1信號軸已經(jīng)被證明存在于胰腺癌中,而EZH2-NOTCH1信號軸是否也存在于GSCs中,同時是否參與了褪黑素對GSCs的作用還尚沒有報道。本實驗主要研究了褪黑素對GSCs的作用及具體的作用機制。
  目的:
  1、研究褪黑素對GSCs增殖、自我更新及干性的

5、作用;
  2、研究EZH2-NOTCH1信號軸在褪黑素起效過程中發(fā)揮的具體作用;
  3、研究EZH2對NOTCH1調(diào)控中的具體作用機制。
  方法:
  第一部分:褪黑素對GSCs增殖、自我更新及干性的影響
  1、U251和T98細胞系中GSCs的培養(yǎng)及驗證
  1.1在干細胞富集培養(yǎng)基(無血清,加入B27, bFGF和EGF因子)培養(yǎng)U251和T98G細胞系,培養(yǎng)至少三周,建立GSCU251和

6、GSCT98G細胞模型。
  1.2 qRT-PCR檢測GSCs干細胞標記物CD133和SOX2的含量,驗證GSCU251和GSCT98G細胞模型是否建立成功。
  2、檢測不同濃度褪黑素對GSCs的生存、增殖能力的影響
  2.1配制含有不同濃度褪黑素(0.1-1000μM)的培養(yǎng)基,培養(yǎng)GSCU251和GSCT98G。
  2.2 CCK-8實驗檢測不同濃度褪黑素對GSCU251和GSCT98G增殖能力的影響

7、。
  3、檢測褪黑素其對GSCs自我更新能力的影響
  通過成球?qū)嶒灆z測不同濃度褪黑素對GSCU251和GSCT98G自我更新能力的影響。
  4、檢測褪黑素對GSCs干性的影響
  qRT-PCR和Western Blot檢測褪黑素對GSCU251和GSCT98G中干性標記物CD133和SOX2表達的影響。
  第二部分:EZH2在褪黑素對GSCs的抑制過程中的作用探究
  1、檢測褪黑素對GSC

8、s中EZH2表達的影響。
  qRT-PCR和Western Blot檢測褪黑素對GSCs中EZH2表達的影響。
  2、EZH2敲除GSCU251模型的建立
  2.1通過EZH2 shRNA轉染GSCU251,建立EZH2敲除GSCU251模型。
  2.2 Western Blot檢測EZH2敲除GSCU251模型建立是否成功。
  3、檢測EZH2敲除后GSCU251的增殖能力、自我更新能力及干性的

9、變化
  敲除GSCU251中的EZH2后,CCK-8實驗檢測GSCU251的生長、增殖能力變化;成球?qū)嶒灆z測GSCU251的自我更新能力變化;qRT-PCR檢測GSCU251中CD133分子表達的變化。
  4、EZH2過表達GSCU251模型的建立
  4.1通過GV230-EZH2質(zhì)粒轉染GSCU251,中建立EZH2過表達GSCU251模型。
  4.2 Western Blot檢測EZH2過表達GSCU

10、251模型建立是否成功。
  5、檢測EZH2過表達后GSCU251的增殖能力、自我更新能力及干性的變化
  GSCU251中的EZH2過表達后,CCK-8實驗檢測GSCU251的生長、增殖能力變化;成球試驗檢測GSCU251的自我更新能力變化;qRT-PCR檢測GSCU251中CD133分子表達的變化。
  6、檢測褪黑素加入后,對照組和EZH2過表達組GSCU251的增殖能力、自我更新能力及干性的變化
  6

11、.1在對照組GSCU251中加入褪黑素進行培養(yǎng),CCK-8、成球?qū)嶒灆z測GSCU251的增殖能力、自我更新能力變化; qRT-PCR檢測GSCU251中CD133分子表達的變化。
  6.2在EZH2過表達組GSCU251中加入褪黑素進行培養(yǎng),CCK-8、成球?qū)嶒灆z測GSCU251的增殖能力、自我更新能力變化; qRT-PCR檢測GSCU251中CD133分子表達的變化。
  第三部分:NOTCH1在EZH2起效過程中的作用

12、及機制
  1、檢測褪黑素對GSCs中NOTCH1表達的影響
  1.1 qRT-PCR檢測褪黑素干預后GSCU251和GSCT98G中NOTCH1及下游因子CCND1,CCNE2和HES1等的mRNA表達量變化。
  1.2 Western Blot檢測褪黑素干預后GSCU251和GSCT98G中NICD1(NOTCH1的胞內(nèi)功能區(qū)域)和HES1的蛋白表達量變化。
  2、檢測EZH2對NOTCH1的調(diào)控作用<

13、br>  2.1通過雙熒光素酶報告實驗檢測EZH2敲除和過表達GSCU251中NOTCH1轉錄活性的變化。
  2.2 Western Blot檢測EZH2敲除和過表達GSCU251中NICD1和HES1的蛋白表達量變化。
  2.3染色質(zhì)免疫共沉淀實驗檢測GSCU251中NOTCH1的啟動子位置EZH2、H3K27me3和SUZ12的聚集情況。
  第四部分:EZH2-NOTCH1信號軸在臨床樣本中的初步探究

14、  1、檢測膠質(zhì)母細胞瘤樣本和正常腦組織樣本中EZH2和NICD1表達的相關性
  1.1選取67例膠質(zhì)母細胞瘤樣本和12例正常腦組織樣本進行EZH2和NICD1指標的免疫組化染色。
  1.2統(tǒng)計學分析膠質(zhì)母細胞瘤樣本中EZH2和NICD1的表達相關性。
  結果:
  第一部分:褪黑素對GSCs增殖、自我更新及干性的影響
  1、U251和T98細胞系中GSCs的培養(yǎng)及驗證
  通過干細胞富集培養(yǎng)

15、基培養(yǎng)U251和T98G細胞系三周后,建立GSCU251和GSCT98G細胞模型。通過qRT-PCR檢測,我們發(fā)現(xiàn),與普通U251和T98G細胞系相比,GSCU251和GSCT98G細胞模型的干細胞標記物CD133和SOX2的含量明顯升高。
  2、檢測不同濃度褪黑素對GSCs的生存、增殖能力的影響
  不同濃度褪黑素處理GSCU251和GSCT98G后,CCK-8實驗結果顯示,100μM和1mM的褪黑素對GSCs的生長產(chǎn)生

16、了抑制作用。
  3、檢測褪黑素其對GSCs自我更新能力的影響
  不同濃度褪黑素處理GSCU251和GSCT98G后,成球?qū)嶒灲Y果顯示,100μM和1mM的褪黑素對GSCs的自我更新產(chǎn)生了抑制作用。
  4、檢測褪黑素對GSCs干性的影響
  qRT-PCR和Western Blot檢測結果表明,1mM的褪黑素對GSCU251和GSCT98G中干性標記物CD133和SOX2表達有明顯的抑制作用。
  第二

17、部分:EZH2在褪黑素對GSCs的抑制過程中的作用探究
  1、檢測褪黑素對GSCs中EZH2表達的影響。
  qRT-PCR和Western Blot檢測結果表明,褪黑素的干預顯著降低了GSCU251和GSCT98G中EZH2的表達量。
  2、EZH2敲除GSCU251模型的建立
  通過EZH2 shRNA轉染GSCU251,建立EZH2敲除GSCU251模型后,Western Blot實驗表明,EZH2敲

18、除GSCU251模型中的EZH2蛋白表達量明顯降低。
  3、檢測EZH2敲除后GSCU251的增殖能力、自我更新能力及干性的變化
  敲除GSCU251中的EZH2后,CCK-8實驗表明,GSCU251的生長、增殖能力顯著降低;成球?qū)嶒灡砻?,GSCU251的自我更新能力顯著降低;qRT-PCR檢測顯示,GSCU251中CD133分子表達量顯著下降。
  4、EZH2過表達GSCU251模型的建立
  通過GV2

19、30-EZH2轉染GSCU251,建立EZH2過表達GSCU251模型后,Western Blot實驗表明,EZH2過表達GSCU251模型中的EZH2蛋白表達量明顯升高。
  5、檢測EZH2過表達后GSCU251的增殖能力、自我更新能力及干性的變化
  GSCU251中的EZH2過表達后,CCK-8實驗表明,GSCU251的生長、增殖能力顯著增強;成球?qū)嶒灡砻?,GSCU251的自我更新能力顯著增強;qRT-PCR檢測顯示

20、,GSCU251中CD133分子表達量顯著升高。
  6、檢測褪黑素加入后,對照組和EZH2過表達組GSCU251的增殖能力、自我更新能力及干性的變化
  6.1對照組GSCU251中加入褪黑素進行培養(yǎng)后,CCK-8、成球?qū)嶒灲Y果顯示,GSCU251的增殖能力、自我更新能力顯著下降;qRT-PCR檢測表明,GSCU251中CD133的表達量明顯降低。
  6.2 EZH2過表達組GSCU251中加入褪黑素進行培養(yǎng)后,C

21、CK-8、成球?qū)嶒灲Y果顯示,GSCU251的增殖能力、自我更新能力顯著下降;qRT-PCR檢測表明,GSCU251中CD133的表達量明顯降低。
  第三部分:NOTCH1在EZH2起效過程中的作用及機制
  1、檢測褪黑素對GSCs中NOTCH1表達的影響
  1.1 qRT-PCR檢測結果顯示,褪黑素干預后GSCU251和GSCT98G中NOTCH1及下游因子CCND1,CCNE2和HES1等的mRNA表達量顯著下

22、降。
  1.2 Western Blot檢測結果也表明,褪黑素干預后GSCU251和GSCT98G中NICD1和HES1的蛋白表達量顯著下降。
  2、檢測EZH2對NOTCH1的調(diào)控作用
  2.1通過雙熒光素酶報告實驗,我們發(fā)現(xiàn),GSCU251中的EZH2敲除和過表后,NOTCH1轉錄活性隨之減弱和增強。
  2.2 Western Blot結果表明,GSCU251中EZH2敲除和過表達后,NICD1和HE

23、S1的蛋白表達量也隨之升高和降低。
  2.3染色質(zhì)免疫共沉淀實驗檢測發(fā)現(xiàn),GSCU251中NOTCH1的啟動子位置可以檢測到EZH2的顯著聚集,而并未檢測到H3K27me3和SUZ12的聚集。同時,褪黑素的干預顯著降低了EZH2在NOTCH1的啟動子區(qū)域的聚集。
  第四部分:EZH2-NOTCH1信號軸在臨床樣本中的初步探究
  1、檢測膠質(zhì)母細胞瘤樣本和正常腦組織樣本中EZH2和NICD1表達的相關性
  

24、1.1免疫組化染色結果顯示,73%的EZH2高表達膠質(zhì)母細胞瘤樣本中也存在著NICD1的高表達。
  1.2統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)母細胞瘤樣本中EZH2和NICD1的表達存在高度的正相關。
  結論:
  1、特定濃度的褪黑素對GSCs增殖、自我更新能力具有顯著地抑制作用,并能顯著降低GSCs的干性。
  2、通過機制實驗,我們發(fā)現(xiàn),褪黑素通過抑制EZH2-NOTCH1信號軸發(fā)揮了抑制GSCs的作用。
  3

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