核心巖藻糖基化修飾調(diào)控周細(xì)胞參與肺間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制.pdf

1、肺間質(zhì)纖維化（Pulmonary Fibrosis）是多種肺間質(zhì)性疾病的共同結(jié)局。其發(fā)病率近年呈上升趨勢(shì)，其預(yù)后較差，診斷后的平均生存時(shí)間不足5年，致死率高，對(duì)人民群眾的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，目前缺乏有效的根治措施。因此延緩肺間質(zhì)纖維化進(jìn)展、降低肺間質(zhì)纖維化發(fā)病率是我國(guó)呼吸系統(tǒng)疾病防治所面臨的巨大挑戰(zhàn)和重大需求。
　　盡管間質(zhì)性肺病的病因機(jī)制復(fù)雜，肺間質(zhì)纖維化是其不斷進(jìn)展的共同病理表現(xiàn)與最后通路，主要表現(xiàn)為：炎癥因子聚集，血管塌陷，肌

2、成纖維細(xì)胞增多進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)沉積，最終導(dǎo)致肺臟纖維化、肺功能喪失。目前缺乏有效手段阻止肺間質(zhì)纖維化進(jìn)展。因此，解析肺間質(zhì)纖維化分子機(jī)制，尋求有效的干預(yù)策略，對(duì)降低肺間質(zhì)纖維化的發(fā)病率具有重大的臨床意義。
　　目前，肺間質(zhì)纖維化的詳細(xì)分子機(jī)制尚不清楚。
　　肺間質(zhì)腔中肌成纖維細(xì)胞的大量聚集與肺部血管塌陷是肺間質(zhì)纖維化的核心環(huán)節(jié)和重要因素。目前對(duì)于肌成纖維細(xì)胞來(lái)源尚不明確，爭(zhēng)議較大。國(guó)內(nèi)外大量研究顯示其來(lái)源主要包括以下幾種途

3、徑：上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)；原位的成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及循環(huán)中的前體細(xì)胞等。伴隨研究的不斷深入，以往研究的熱點(diǎn)“EMT”觀點(diǎn)因在動(dòng)物體內(nèi)無(wú)法復(fù)制，而受到挑戰(zhàn)。新近有學(xué)者利用遺傳命運(yùn)圖譜技術(shù)提出在肺間質(zhì)纖維化中周細(xì)胞(pericyte)是肌成纖維細(xì)胞的主要來(lái)源。
　　周細(xì)胞活化后的一個(gè)重要效應(yīng)是：向肺間質(zhì)腔遷移，并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成。周細(xì)胞活

4、化后的另一個(gè)重要效應(yīng)是：導(dǎo)致肺臟微血管塌陷。由此可見(jiàn)：周細(xì)胞活化是導(dǎo)致肺間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞聚集與肺部微血管塌陷的重要連接點(diǎn)！深入研究周細(xì)胞活化機(jī)制及其活化后所導(dǎo)致的重要分子效應(yīng)將為肺間質(zhì)纖維化的治療提供新的研究思路和治療策略。
　　周細(xì)胞活化的機(jī)制是什么目前仍不清楚。相關(guān)研究表明血管內(nèi)皮細(xì)胞與周細(xì)胞的特殊結(jié)構(gòu)相互分泌的細(xì)胞因子如：TGF-β、PDGF配體等進(jìn)而活化TGF-β、PDGF等通路，最終誘導(dǎo)周細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程。上述研究表明：多條

5、信號(hào)通路的活化是周細(xì)胞轉(zhuǎn)化發(fā)生的重要基礎(chǔ)。但是又是什么調(diào)控了這些信號(hào)通路的活化？能否找到調(diào)控它們活性的共同靶點(diǎn)？
　　隨著人類基因組計(jì)劃的完成以及蛋白質(zhì)組技術(shù)的不斷發(fā)展，糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)成為近幾年研究的熱點(diǎn)。糖蛋白在翻譯后必須借助糖基化修飾完成蛋白質(zhì)功能。核心巖藻糖基化（core fucosylation，CF）是重要的蛋白質(zhì)糖修飾，是由α-1,6核心巖藻糖轉(zhuǎn)移酶（Fucosyltransferase8，F(xiàn)UT8）催化巖藻糖基由G

6、DP-Fuc轉(zhuǎn)移至糖蛋白N-連接寡糖的核心結(jié)構(gòu)GlcNAc上，形成核心巖藻糖。FUT8是哺乳動(dòng)物中僅有的一種核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)調(diào)控受體蛋白功能來(lái)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。
　　所以我們思考：在肺間質(zhì)纖維化的進(jìn)程中，多條信號(hào)通路的活化是關(guān)鍵，那么CF修飾是否是調(diào)控這些信號(hào)通路的共同靶點(diǎn)？
　　然而蛋白質(zhì)CF修飾在肺間質(zhì)疾病領(lǐng)域的研究尚屬空白。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：發(fā)現(xiàn)了TIMP-1在肺、腎間質(zhì)纖維化中的作用及CF調(diào)控腎臟纖維化

7、中TIMP-1。此外，我們課題組的前期實(shí)驗(yàn)及國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道：調(diào)控周細(xì)胞轉(zhuǎn)分化重要通路中的關(guān)鍵受體PDGFβR、TGF-βR均為糖蛋白。
　　上述研究結(jié)果表明CF修飾可能參與周細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而且在肌成纖維細(xì)胞聚集后產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)沉積可能發(fā)揮重要作用，貫穿肺間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程。
　　我們提出科學(xué)假設(shè)：CF修飾可能是調(diào)控周細(xì)胞轉(zhuǎn)化及肺間質(zhì)纖維化進(jìn)展中的重要靶點(diǎn)，因此以此為靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)很可能成為未來(lái)治療肺間質(zhì)纖維化的新策略。然而

8、，CF修飾在肺間質(zhì)纖維化進(jìn)展中的改變是什么？周細(xì)胞轉(zhuǎn)化及肺間質(zhì)纖維化中鍵蛋白是什么？是否受CF調(diào)控？干預(yù)CF修飾后是否可以逆轉(zhuǎn)周細(xì)胞轉(zhuǎn)化及肺間質(zhì)纖維化的進(jìn)展？這些都是尚未解決的科學(xué)問(wèn)題。
　　因此，要解決上述科學(xué)問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)擬利用體外實(shí)驗(yàn)結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，深入研究CF調(diào)控周細(xì)胞轉(zhuǎn)化與肺間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制，這些信息將有利于我們更加清楚的把握CF修飾調(diào)控周細(xì)胞轉(zhuǎn)化機(jī)制進(jìn)而解析肺間質(zhì)纖維化，為發(fā)現(xiàn)治療肺間質(zhì)纖維化提供更加精準(zhǔn)的靶向藥物。<

9、br>　　因此本課題擬解決“CF修飾是調(diào)控周細(xì)胞轉(zhuǎn)化及減輕肺間質(zhì)纖維化的重要調(diào)控點(diǎn)”的觀點(diǎn)，為促進(jìn)糖生物學(xué)與肺間質(zhì)纖維化相互滲透、治療肺間質(zhì)纖維化提供全新思路與治療策略。
　　第一部分體外小鼠肺臟周細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
　　目的：
　　建立體外小鼠肺臟周細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法，明確周細(xì)胞的生物學(xué)特征。
　　方法：
　　1利用免疫磁珠方法分離純化小鼠肺臟周細(xì)胞,通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察周細(xì)胞的形態(tài)。2利用PDGFβR、

10、α–SMA、CD73、Desmin多種周細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行免疫熒光鑒定。3應(yīng)用CCK8方法測(cè)定肺臟周細(xì)胞生長(zhǎng)情況并繪制生長(zhǎng)曲線圖。
　　結(jié)果：
　　1免疫磁珠分選小鼠肺臟周細(xì)胞約12天左右融合，傳代后生長(zhǎng)及融合速度加快；傳代后周細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，7天左右融合，光鏡下觀察周細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,呈星形狀或不規(guī)則形狀。2免疫熒光方法鑒定周細(xì)胞多種標(biāo)記物表達(dá)陽(yáng)性（PDGFβR、CD73、Desmin），生理情況下，α-SMA表達(dá)陰性。3細(xì)胞

11、生長(zhǎng)曲線測(cè)定周細(xì)胞傳代后（P1）:第4天進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，第8天進(jìn)入平臺(tái)期。
　　結(jié)論：
　　1免疫磁珠分選法可獲得高純度和可傳代的小鼠肺臟周細(xì)胞。2選擇原代或者第一代周細(xì)胞能夠更好地應(yīng)用周細(xì)胞相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。
　　第二部分核心巖藻糖基化修飾對(duì)周細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響
　　目的：
　　觀察阻抑核心巖藻糖基化修飾能否逆轉(zhuǎn)周細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　　方法：
　　1體外采用外源性TGF-β1（Tr

12、ansform growth factor-β1，TGF-β1）刺激因子建立周細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化模型，光鏡下觀察48h后周細(xì)胞發(fā)生的形態(tài)變化。2利用免疫熒光雙染的方法確定周細(xì)胞及肺臟是否表達(dá)核心巖藻糖基化修飾及建立體外、體內(nèi)纖維化模型后CF修飾的水平表達(dá)變化及周細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中核心巖藻糖基化水平、α-SMA及FUT8的表達(dá)變化。3體內(nèi)外分別采用FUT8siRNA及FUT8shRNA技術(shù)沉默周細(xì)胞及小鼠肺臟內(nèi)源性FUT8基

13、因，驗(yàn)證FUT8基因表達(dá)。4體內(nèi)研究采用博萊霉素誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化模型，免疫熒光共染方法確定周細(xì)胞有無(wú)存在遷移及CF對(duì)周細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。
　　結(jié)果：
　　1正常周細(xì)胞及肺臟存在中等量核心巖藻糖基化水平，體外加入終濃度5ng/mL的TGF-β1孵育周細(xì)胞48h后，免疫熒光結(jié)果顯示周細(xì)胞及肺臟表面CF表達(dá)水平明顯上調(diào)伴隨周細(xì)胞轉(zhuǎn)分化全過(guò)程。2體外建立周細(xì)胞轉(zhuǎn)化模型，免疫熒光結(jié)果顯示周細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，α-SMA的表達(dá)上

14、調(diào)；體內(nèi)建立博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化模型，免疫熒光及免疫印跡結(jié)果顯示：與正常組相比，肺臟間質(zhì)腔中PDGFR及α-SMA的表達(dá)明顯增加（P<0.05）。3 FUT8siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染周細(xì)胞48h后，明顯抑制周細(xì)胞轉(zhuǎn)化及上述標(biāo)記蛋白的表達(dá)；腺病毒包裝FUT8shRNA經(jīng)尾靜脈注射后，抑制肺臟肺核心巖藻糖基化修飾水平后，免疫熒光及免疫印跡顯示肺臟α-SMA表達(dá)明顯下降（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1在肺間質(zhì)纖維化模型中，周

15、細(xì)胞是肌成纖維細(xì)胞的重要來(lái)源。2 FUT8催化的核心巖藻糖基化修飾介導(dǎo)了周細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的全過(guò)程，抑制核心巖藻糖基化修飾后可以明顯抑制周細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　　第三部分核心巖藻糖基化修飾調(diào)控周細(xì)胞轉(zhuǎn)化機(jī)制
　　目的：
　　解析在BLM誘導(dǎo)小鼠肺間質(zhì)纖維化模型中，CF調(diào)控周細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)制及肺間質(zhì)纖維化進(jìn)程中CF對(duì)關(guān)鍵蛋白（PDGFβR、TGF-βRⅠ、p-Erk、p-Smad2/3）蛋白的影響。
　　方法：

16、>　　1利用外源性TGF-β1誘導(dǎo)周細(xì)胞轉(zhuǎn)化體外模型及BLM致小鼠肺間質(zhì)纖維化體內(nèi)模型中，應(yīng)用免疫熒光檢測(cè)周細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān)的PDGFβ/Erk、TGF/Smad2/3信號(hào)通路的活化。2體外 FUT8siRNA技術(shù)及利用腺病毒包裝的FUT8shRNA經(jīng)尾靜脈注射小鼠體內(nèi)沉默周細(xì)胞及肺臟CF后，通過(guò)熒光雙染及免疫沉淀方法檢測(cè)PDGFβR、TGF-βRⅠ受體蛋白是否受到核心巖藻糖基化修飾及CF修飾對(duì)其PDGFβ/Erk、TGF/Smad2/3信

17、號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的影響。
　　結(jié)果：
　　1外源性刺激因子TGF-β1（5ng/ml）孵育周細(xì)胞48小時(shí)后，免疫熒光雙染顯示周細(xì)胞轉(zhuǎn)分化關(guān)鍵受體蛋白PDGFR、TGF-βRI顯著升高，其CF修飾水平亦顯著升高；PDGFR、TGF-βRI受到CF修飾，F(xiàn)UT8siRNA阻抑核心巖藻糖基化修飾并不影響受體蛋白的表達(dá)。2外源性刺激因子TGF-β1（5ng/ml）孵育周細(xì)胞48小時(shí)后，PDGF、TGF-β信號(hào)通路被激活，免疫熒光方法

18、顯示下游磷酸化蛋白p-Erk、p-Smad2/3表達(dá)明顯增加；阻抑核心巖藻糖基化修飾后明顯下調(diào)p-Erk、p-Smad2/3表達(dá)。3體內(nèi)建立博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺間質(zhì)纖維化模型，于28天作為造模終點(diǎn)，激活肺間質(zhì)臟纖維化及周細(xì)胞轉(zhuǎn)分化相關(guān)的TGF-β、PDGF信號(hào)通路，免疫熒光雙染、免疫印跡及免疫沉淀顯示肺間質(zhì)纖維化過(guò)程中關(guān)鍵蛋白PDGFβR、TGF-βRI表達(dá)及CF修飾水平顯著升高，同時(shí)受到CF修飾；FUT8shRNA阻抑核心巖藻糖基化修

19、飾并不影響受體蛋白的表達(dá)，但明顯抑制下游磷酸化蛋白p-Erk、p-Smad2/3的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1 PDGFβ/Erk、TGF/Smad2/3信號(hào)通路的活化參與了周細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的全過(guò)程。2關(guān)鍵受體蛋白PDGFβR及TGF-βRI受到 CF修飾。3阻抑核心巖藻糖基化修飾明顯抑制PDGFβ/Erk、TGF/Smad2/3信號(hào)通路中下游磷酸化蛋白的表達(dá),抑制周細(xì)胞轉(zhuǎn)化及肺間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。
　　第四部分核

20、心巖藻糖基化在周細(xì)胞轉(zhuǎn)化及肺間質(zhì)纖維化進(jìn)展中的修飾特征
　　目的：
　　探討核心巖藻糖基化修飾在周細(xì)胞轉(zhuǎn)化及肺間質(zhì)纖維化進(jìn)程中的變化特征及阻抑CF修飾后對(duì)肺臟病理及細(xì)胞外基質(zhì)沉積的保護(hù)作用。
　　方法：
　　1利用外源性TGF-β1誘導(dǎo)周細(xì)胞轉(zhuǎn)化體外模型及BLM致小鼠肺間質(zhì)纖維化體內(nèi)模型，應(yīng)用免疫熒光共染及免疫印跡方法檢測(cè)FUT8與α-SMA蛋白表達(dá)變化。2體外利用FUT8siRNA技術(shù)及體內(nèi)利用腺病毒包裝的FU

21、T8shRNA經(jīng)尾靜脈注射小鼠體內(nèi)抑制CF修飾后，應(yīng)用免疫熒光共染及免疫印跡方法檢測(cè)抑制CF后對(duì)FUT8與α-SMA蛋白表達(dá)的影響。3體內(nèi)建立博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺間質(zhì)纖維化模型，于28天作為造模終點(diǎn)，建立肺臟纖維化病理，利用腺病毒包裝的FUT8shRNA經(jīng)尾靜脈注射小鼠體內(nèi)，應(yīng)用病理染色及免疫組化方法檢測(cè)對(duì)CollageⅠ、CollageⅢ的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1在外源性TGF-β1誘導(dǎo)周細(xì)胞轉(zhuǎn)化體外模型及博來(lái)霉素誘

22、導(dǎo)小鼠肺間質(zhì)纖維化體內(nèi)模型中，F(xiàn)UT8與α-SMA的表達(dá)明顯上調(diào)且呈正相關(guān)。2體外FUT8siRNA及體內(nèi)FUT8shRNA技術(shù)抑制CF表達(dá)后，逆轉(zhuǎn)了周細(xì)胞轉(zhuǎn)化，F(xiàn)UT8及α-SMA表達(dá)明顯下調(diào)。3博來(lái)霉素建立肺間質(zhì)纖維化小鼠模型后，病理染色顯示肺臟失去原有結(jié)構(gòu)，肺間質(zhì)腔明顯增厚，膠原纖維明顯增加；免疫組化顯示肺臟中CollageⅠ、CollageⅢ表達(dá)明顯增加。4 FUT8shRNA阻抑體內(nèi)核心巖藻糖基化修飾后，病理染色顯示肺臟恢復(fù)原