DENV-2感染的HUVECs與CD4P+P T細胞相互作用對主要炎性細胞因子表達的影響.pdf

1、目的：
　　研究人原代臍靜脈內皮細胞（primary human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）被登革Ⅱ型病毒（DENV-2）感染后，在與CD4P+P T細胞共培養(yǎng)條件下，HUVECs和CD4+T細胞對主要炎性細胞因子IL-6、IL-8以及IL-4、IL-17、TNF-α、IFN-γ的mRNA表達的相互影響。
　　方法：
　　C6/36細胞增殖病毒，RT-PCR擴增DE

2、NV-2的NS1部分序列（413bp）鑒定病毒，并采用TCID50法測定病毒效價。HUVECs常規(guī)復蘇、培養(yǎng)，通過流式細胞術和免疫組化法分別檢測 HUVECs表面 CD31分子的表達和胞漿內Ⅷ因子相關抗原，以鑒定HUVECs。密度梯度離心法提取濃縮白細胞中的PBMC，免疫磁珠法陰性分選CD4P+P T細胞，并用流式檢測細胞表面CD3、CD4分子的表達，鑒定CD4+ T細胞純度。用抗CD3和抗CD28單克隆抗體刺激細胞后，流式檢測CD4P

3、+T細胞表面CD69的表達，檢測分選出的CD4P+T細胞的活性。用10P3PTCID50的DENV-2感染經S1P1特異性受體激動劑CYM-5442作用24小時后的HUVECs與CD4P+T細胞共培養(yǎng)后，Real-time PCR檢測HUVECs中病毒NS1部分序列和IL-6、IL-8 mRNA相對表達的動態(tài)變化，以及CD4P+ T細胞中IL-4、IL-17、TNF-α、IFN-γ的mRNA相對表達的動態(tài)變化；雙抗體夾心ELISA法檢測

4、細胞培養(yǎng)上清中IL-6和IL-8的表達。
　　結果：
　　RT-PCR擴增NS1部分序列經瓊脂糖電泳，產物長度在400bp左右，與預期413bp相符，證實該病毒為DENV-2。TCID50法測定病毒的滴度為10P-6.6P/0.1ml。流式細胞儀檢測 CD31表面分子表達率為99.86%，免疫組化法檢測HUVECs的Ⅷ因子相關抗原，可見胞漿內呈棕黃色，與HUVECs特征相符。流式檢測經免疫磁珠陰性分選的CD4+T細胞純度達9

5、8.02%，經抗CD3和抗CD28單克隆抗體刺激后12h后，CD69的表達由2.08%增至75.24%，活化明顯。DENV-2感染HUVECs后病毒NS1的表達逐漸增加至24h（3.03±0.26，P<0.001）達到峰值后下降，而感染DENV-2后與CD4+ T細胞共培養(yǎng)組的病毒NS1相對表達量總體比感染組低，且呈下降趨勢。DENV-2感染后IL-6和IL-8表達均有上調，與CD4+ T細胞共培養(yǎng)后，IL-6和IL-8在各時間點表達均

6、明顯升高（P<0.001）。CYM-5442預處理的共培養(yǎng)感染組，IL-6 mRNA表達在24h（28.91±2.34，P<0.05）、36h（19.36±0.1，P<0.05）和72h（13.84±0.82，P<0.05）顯著下降，IL-8的mRNA表達在8h（9.91±1.24，P<0.05）、12h（12.24±2.06，P<0.05）、24h（4.9±0.61，P<0.05）、48h（2.11±0.25，P<0.05）顯著下降。

7、與感染后的HUVECs共培養(yǎng)后CD4+T細胞的IL-4、IL-17、TNF-α、IFN-γ的mRNA表達均明顯升高。而與CYM-5442處理后的HUVECs感染組共培養(yǎng)后，表達有不同程度的下降.
　　結論：
　　DENV-2感染原代HUVECs后能檢測到NS1的表達，且在24h最高，與CD4P+ T細胞共培養(yǎng)后病毒NS1的表達被抑制。CD4+ T細胞不僅能增強 HUVECs的活化，且能被感染后的HUVECs活化，Th1、Th