TET1酶催化核酸堿基羥基化選擇性的化學(xué)研究.pdf

1、目的:
　　作為催化氧化脫甲基的酶，TET1(ten-eleven translocation)酶能夠誘導(dǎo)5-甲基胞嘧啶(5mC)發(fā)生羥化生成5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)，而后，又被證明能夠催化胸腺嘧啶(T)，轉(zhuǎn)化生成5-羥甲基尿嘧啶(5hmU)。研究表明許多中藥成分能抑制其作用，但機(jī)制尚未明確。為了探索藥物對(duì)TET1酶的作用，首先需要對(duì)TET1酶作用機(jī)制有更深入的了解。本實(shí)驗(yàn)旨在從化學(xué)角度上研究TET1酶的作用機(jī)制以及其誘導(dǎo)的羥

2、基化反應(yīng)的選擇性，從而總結(jié)出此類反應(yīng)的一般規(guī)律，為研究核酸氧化脫甲基作用提供依據(jù)，為闡明核酸羥基化與蛋白羥基化的機(jī)制提供化學(xué)依據(jù)，為開(kāi)發(fā)基于表觀遺傳學(xué)的新型的藥物提供理論參考。
　　方法:
　　本實(shí)驗(yàn)以TET1酶為研究對(duì)象，選取具有代表性的有機(jī)化合物作為底物，包括環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷、乙基苯、異丙苯、水楊酸甲酯、水楊酸乙酯、2-氨基-4，6-二甲基嘧啶、6-甲基嘌呤、L-甲硫氨酸、茶堿以及5-乙基尿嘧啶等，在Fe(Ⅱ)和α-K

3、G存在的條件下發(fā)生體外反應(yīng)。反應(yīng)液采用氣質(zhì)聯(lián)用和液質(zhì)聯(lián)用的檢測(cè)方法分析，通過(guò)分析產(chǎn)物質(zhì)譜圖中的碎片離子峰，判斷產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)以及被取代H原子的位置和發(fā)生反應(yīng)C-H鍵的類型，從而推斷出TET1酶羥化核酸堿基反應(yīng)的選擇性。
　　結(jié)果:
　　1)在T與TET1酶的反應(yīng)液中檢測(cè)到5hmU和尿嘧啶（脫甲基產(chǎn)物）的存在，且生成5hmU的體外轉(zhuǎn)化率為9.2％;
　　2)環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷反應(yīng)液中未檢測(cè)到羥化物的存在;
　　3)乙基

4、苯、異丙苯、2-氨基-4，6-二甲基嘧啶以及6-甲基嘌呤中檢測(cè)到羥化物存在，且OH取代發(fā)生在與雙鍵相連的-CH3上;
　　4)在水楊酸甲酯、水楊酸乙酯（-CH3與O原子相連）、L-甲硫氨酸、(-CH3與S原子相連)、茶堿（-CH3與N原子相連）的反應(yīng)液中均檢測(cè)到羥化物的離子峰;
　　5)5-乙基尿嘧啶反應(yīng)液中并沒(méi)有檢測(cè)到尿嘧啶（脫乙基產(chǎn)物）的存在。
　　結(jié)論:
　　在α-KG、Fe(Ⅱ)存在的條件下，TET1酶能

5、催化T中-CH3上的H原子羥基化，生成5hmU。能被TET1酶催化羥基化的C-H鍵主要有四類，即烯丙型C-H鍵以及與O、S、N相連的-CH3上的C-H鍵。乙基以及異丙基上的與端基H原子，不能被TET1酶催化羥基化。這是因?yàn)榕c烯丙型C-H鍵和與O、S、N相連的C-H鍵，受p-π共軛，或O、S、N的吸電子誘導(dǎo)效應(yīng)（-Ⅰ）影響，具有較小的解離能。而乙基以及異丙基上端基C-H鍵具有較大的解離能。這提示TET1酶能催化DNA核酸堿基中的甲基的羥基