離體椎間盤模型中壓應力對髓核組織的生物效應及促退變機制的研究.pdf

1、背景：
　　本研究在該智能化仿生組織培養(yǎng)系統(tǒng)的基礎上，通過相關策略改善椎間盤中央髓核組織營養(yǎng)供應并優(yōu)化相關培養(yǎng)參數，優(yōu)效建立了離體椎間盤器官培養(yǎng)模型;然后在該模型中，通過施加不同參數的仿生壓應力，觀察了壓應力對椎間盤髓核細胞的生物學效應“窗”;最后，深入研究了高負荷壓應力促進椎間盤退變的可能途徑及其機制。
　　方法：
　　第一部分
　　1.分離兔椎間盤，去除兩端骨性終板保留軟骨終板，隨后將離體兔椎間盤隨機分為對照

2、組和實驗組，實驗組中對椎間盤進行預處理，即手術去除約1/3外層纖維環(huán)后，低濃度胰酶控制性疏松殘余外層纖維環(huán)組織;對照組中椎間盤不做該處理。
　　2.椎間盤預處理后，體外用亞甲藍擴散實驗觀察兩組椎間盤中溶質擴散效率，用組織形態(tài)學染色(HE)觀察椎間盤軟骨終板和內層纖維環(huán)的結構變化。
　　第二部分
　　1.按第一部分方法分離豬椎間盤并進行椎間盤培養(yǎng)前預處理。
　　2.利用該智能化仿生組織培養(yǎng)系統(tǒng)，首先將豬椎間盤置于不

3、同葡萄糖水平(低糖:1.0 g/L;普糖:2.0 g/L;高糖:4.5 g/L)、不同滲透壓水平(低滲:330 mOsm/kg，等滲:430 mOsm/kg，高滲:550 mOsm/kg)和不同血清水平（5％，10％和20％）培養(yǎng)環(huán)境中進行灌注培養(yǎng)7天，通過檢測髓核細胞活力、髓核細胞胞外基質代謝相關分子的基因表達和髓核組織中生化組分(GAG和HYP)含量，篩選出最能維持髓核組織生物活性的葡萄糖水平、滲透壓水平和血清水平。
　　第三

4、部分
　　1.按第一和第二部分方法進行豬椎間盤分離和椎間盤培養(yǎng)前預處理，并建立離體豬椎間盤器官培養(yǎng)模型。
　　2.利用該智能化仿生組織培養(yǎng)系統(tǒng)對灌注培養(yǎng)中的椎間盤進行施力刺激7天，分別觀察不同仿生壓應力大小(0.1 MPa、0.2 MPa、0.4 MPa、0.8 MPa和1.3 MPa，其他應力參數為:1.0Hz的應力頻率，2h每天的應力施加時間)、不同仿生壓應力頻率(0.1Hz、0.5 Hz、1.0 Hz、3.0 Hz和5

5、.0 Hz，其他應力參數為:0.4 MPa的應力大小，2h每天的應力施加時間）和不同仿生壓應力作用時間(1h/每天、2h/每天、4h/每天和8h/每天，其他應力參數為:0.4 MPa的應力大小，1.0 Hz的應力頻率)對椎間盤髓核組織的生物學效應。沒有進行壓應力刺激的椎間盤視作對照組。
　　第四部分
　　1.按第一部分方法分離大鼠椎間盤，獲取中央髓核組織后，用胰酶和Ⅰ型膠原酶消化法獲取髓核細胞，采用雙相接種的方法將髓核細胞接

6、種至支架材料上。然后將含髓核細胞的支架材料置于該智能化仿生組織培養(yǎng)系統(tǒng)中進行灌注培養(yǎng)5天。同時，每天對髓核細胞施加不同負荷的壓應力刺激4h，具體分組為無應力對照組、低負荷壓應力（2％壓縮形變）組和高負荷壓應力（20％壓縮形變）組，壓應力頻率為1.0 Hz。同時，在高負荷壓應力組中，利用通路抑制劑SB203580和清除劑NAC觀察p38 MAPK通路和胞內活性氧(ROS)蓄積在高負荷壓應力對髓核細胞影響中的作用。培養(yǎng)結束后，分析各組髓核細

7、胞增殖情況、衰老相關β-半乳糖苷酶活性、G1期細胞周期阻滯比例、衰老相關標志物(p16和p53)的基因和蛋白表達、端粒酶活性、胞內ROS蓄積情況、髓核細胞胞外基質代謝和p38 MAPK通路活性。
　　2.分離大鼠椎間盤后，利用該智能化仿生組織培養(yǎng)系統(tǒng)，建立大鼠離體椎間盤器官培養(yǎng)模型。對離體大鼠椎間盤組織進行施力灌注培養(yǎng)10天，分組為:無壓應力對照組、低負荷壓應力(0.1 MPa)組和高負荷壓應力(1.3 MPa)組，壓應力施加頻率

8、為1.0 Hz，每天施加時間為4h。培養(yǎng)結束后，分析各組髓核細胞衰老相關β-半乳糖苷酶活性、衰老相關標志物(p16和p53)的基因和蛋白表達、端粒酶活性、胞內ROS蓄積情況、髓核細胞胞外基質代謝和p38 MAPK通路活性。
　　第五部分
　　1.按第一部分分離大鼠椎間盤，獲取中央髓核組織后，用胰酶和Ⅰ型膠原酶消化法獲取髓核細胞，采用雙相接種的方法將髓核細胞接種至支架材料上。
　　2.將含髓核細胞的支架材料置于該智能化仿

9、生組織培養(yǎng)系統(tǒng)中進行灌注培養(yǎng)5天。同時，每天對髓核細胞施加不同負荷的壓應力刺激4h，具體分組為無應力對照組、低負荷壓應力（2％壓縮形變）組和高負荷壓應力（20％壓縮形變）組，壓應力頻率為1.0Hz。施力培養(yǎng)結束后，分析髓核細胞凋亡情況、Caspase3活性、凋亡相關分子(Bcl-2，Bax，Caspase3)的基因表達、凋亡相關分子(Bcl-2，Bax，Cleaved-caspase3)的蛋白表達、N-CDH的基因和蛋白表達，PI3K/

10、Akt通路活性及下游GSK-3β的活性。
　　結果：
　　第一部分
　　1.椎間盤器官培養(yǎng)前經該預處理方法處理后，內層纖維環(huán)和上下端軟骨終板沒有明顯結構性破壞，并且溶質分子更加容易擴散至椎間盤髓核組織。
　　2.培養(yǎng)周期中，與對照組椎間盤相比，實驗組椎間盤髓核組織細胞活力明顯增高、胞外基質大分子的基因和蛋白表達升高、胞外基質降解酶的基因表達下調、髓核組織主要胞外基質組分的含量明顯升高。
　　第二部分

11、　　1.椎間盤在不同葡萄糖水平、不同滲透壓水平和不同血清水平培養(yǎng)7天后，發(fā)現高糖(4.5 g/L)、等滲(430 mOsm/kg)和10％血清的培養(yǎng)條件能較好地維持椎間盤髓核組織細胞活力、胞外基質大分子及基質降解酶抑制因子的基因表達、胞外基質主要生化組分(GAG和HYP)的含量，同時這些培養(yǎng)條件可一定程度上降低基質降解酶的基因表達。
　　2.與新鮮髓核組織比較，椎間盤在該優(yōu)化培養(yǎng)環(huán)境中（高糖、等滲、10％血清）培養(yǎng)14天后，髓核組

12、織在細胞活力、細胞形態(tài)及分布、組織親水性，和胞外基質合成代謝方面仍保持較好的生物活性。
　　第三部分
　　1.各壓應力組間比較，在1.3 MPa組、5.0 Hz組和8h組中，椎間盤髓核組織中細胞凋亡率明顯增高，胞外基質大分子表達降低，基質降解酶的表達升高，髓核組織GAG的含量下降，髓核組織collagenⅡ蛋白表達降低。
　　2.與無壓應力對照組比較，其他壓應力大小(0.1-0.4 MPa)組、壓應力頻率(0.1-3.

13、0Hz)組和壓應力作用時間(1-4 h)組在髓核細胞活力、髓核組織胞外基質代謝相關分子的表達和髓核組織GAG含量上可保持相對“健康”的狀態(tài)。
　　第四部分
　　1.髓核細胞三維培養(yǎng)模型和椎間盤器官培養(yǎng)模型中，相對于低負荷壓應力組和對照組而言，高負荷壓應力可增加髓核細胞衰老相關β-半乳糖苷酶活性，抑制髓核細胞增殖活性和端粒酶活性，上調衰老相關標志物(p16和p53)的表達，降低髓核細胞胞外基質生物合成能力。同時，高負荷壓應力可

14、顯著增加胞內ROS蓄積，并增加p38 MAPK通路活性。
　　2.髓核細胞三維培養(yǎng)模型中，在高負荷壓應力下，加入ROS清除劑NAC后，發(fā)現衰老相關β-半乳糖苷酶活性降低，髓核細胞增殖活性和端粒酶活性增加，衰老相關標志物(p16和p53)的表達下調，髓核細胞胞外基質生物合成能力也有增強。另外，NAC可有效地減少髓核細胞胞內ROS蓄積，但NAC對p38 MAPK通路的活性無明顯影響。
　　第五部分
　　1.相對于對照組和低

15、負荷壓應力組而言，高負荷壓應力下髓核細胞凋亡率和Caspase3活性明顯增加，抗凋亡分子Bcl-2的表達降低，促凋亡分子(Bax和Caspase3/Cleaved-caspase3)的表達增加。同時發(fā)現高負荷壓應力下，N-CDH的表達和PI3K/Akt通路活性明顯降低，但GSK-3β蛋白活性增強。
　　2.高負荷壓應力下，髓核細胞過表達N-CDH后，發(fā)現細胞凋亡率和Caspase3活性降低、抗凋亡分子Bcl-2的表達升高，促凋亡分

16、子(Bax和Caspase3/Cleaved-caspase3)的表達下降，同時PI3K/Akt通路活性增加，但GSK-3β蛋白活性減弱。
　　結論：
　　1.本研究建立了一種椎間盤培養(yǎng)前預處理方法，該預處理方法可促進溶質分子擴散至椎間盤中央髓核髓核組織;在14天的離體椎間盤器官灌注培養(yǎng)周期中，該方法能保持較穩(wěn)定的髓核細胞活力和胞外基質合成。
　　2.本研究在智能化仿生組織培養(yǎng)系統(tǒng)的基礎上，優(yōu)化了椎間盤體外培養(yǎng)時的培養(yǎng)

17、基條件，發(fā)現高糖(4.5 g/L)、等滲(430 mOsm/kg)和10％血清組合的優(yōu)化培養(yǎng)條件能使椎間盤髓核組織保持與新鮮髓核組織相近的生物活性。
　　3.本研究中證明高強度、高頻率及長時間的壓應力刺激均可促進離體椎間盤髓核組織中細胞凋亡并破壞胞外基質的自穩(wěn)態(tài);但一定范圍的壓應力大小(0.1-0.4 MPa)、壓應力頻率(0.1-3.0 Hz)和壓應力作用時間(1-4 h)可使離體椎間盤髓核組織保持相對“健康”的生物活性。